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Cone de plastique jaune clair dans un bocal au dessus d'une paillasse de laboratoire.. © Bertrand NICOLAS - Inra, NICOLAS Bertrand

 Les biotechnologies vertes, nouvelles pistes pour l’agriculture

Transgénèse et recombinaison homologue

La transgénèse permet théoriquement de transférer du matériel génétique d’un organisme dans un autre, quelle que soit l’espèce. La transgénèse à l’Inra est avant tout un outil de connaissance des génomes qui est pratiqué en laboratoire. La recombinaison homologue offre un nouveau champ pour la transgénèse en permettant une insertion ciblée des transgènes. Elle est opérationnelle actuellement chez les bactéries et les levures, mais de nouvelles méthodes devraient permettre de l'utiliser aussi chez les végétaux et les animaux.

Mis à jour le 08/02/2013
Publié le 18/10/2012

. © inra, William Beaucardet
© inra, William Beaucardet

Les récentes connaissances sur la plasticité des génomes remettent en cause une vision fixiste du génome et jusqu’à la pertinence de la notion d’espèce. En effet, le génome d'un organisme subit en permanence des remaniements : mutations mais aussi échanges de matériel génétique, au sein d'une cellule, entre noyaux, chloroplastes ou mitochondries, et enfin, présence dans le génome d'"éléments sauteurs" (appelés transposons). La transgénèse vise à transférer un gène d’un organisme à l’autre de façon contrôlée. Elle est utilisée couramment au laboratoire pour vérifier la fonction présumée d’un gène.

La transgénèse revisitée

De nouvelles méthodologies rapportées dans plusieurs articles récents sont de nature à bouleverser les méthodes de transgénèse en permettant une insertion ciblée du transgène. Elles permettront aussi de modifier spécifiquement la séquence d’un gène sans modifier son environnement génomique.

La plupart des techniques de transgénèse employées jusqu’à présent conduisaient à une intégration du transgène au hasard dans le génome, avec plusieurs inconvénients :

-          insertions multiples

-          remaniements du transgène

-          insertions dans des gènes, perturbations du génome

-          effet de position : insertion dans de la chromatine « silencieuse », défavorable à l’expression du transgène

-          instabilité du transgène, surtout dans le cas d’insertions multiples. L’instabilité proviendrait de la possibilité de formation de boucles entre les séquences homologues et élimination par digestion-ligation.

 

Les nouvelles méthodologies font intervenir des enzymes capables de couper l’ADN à l’endroit précis où l’on veut intervenir (méganucléases), facilitant ainsi l’insertion ciblée du transgène par recombinaison homologue (RH). L’amélioration de la RH obtenue par l’emploi de ces enzymes est sans commune mesure avec tous les efforts déployés jusqu’à présent, les taux de réussite étant multipliés par 1 000 à 10 000 (l’insertion ciblée peut atteindre quelques pourcents de cellules, contre 1/100 000 ou 1/1000 000 sans enzyme).

De nombreuses applications

-          insertion ciblée d’un gène

-          inactivation d’un gène (knock out) : coupure dans le gène et sélection d’un évènement naturel de réparation défectueuse. Cette technique équivaut à une mutation ciblée. C’est la seule application qui ne nécessite pas l’introduction dans le noyau d’un ADN matrice.

-          ou au contraire réparation d’un gène : coupure dans un gène muté et réparation en restaurant la séquence initiale grâce à l’introduction du gène normal comme matrice. Exemple : restauration du gène muté de la xérodermie (sensibilité à la lumière) dans des cellules en culture et greffe des cellules redevenues saines chez l’homme.

-          modification d’un allèle : coupure dans le gène et réparation en utilisant comme matrice l’allèle que l’on veut introduire. On obtient alors le même résultat qu’en réalisant des croisements mais dans un délai infiniment plus court.

-          élimination d’un fragment d’ADN : coupure et réparation avec une matrice portant la délétion voulue.

Autres stratégies pour cibler un gène donné

Il existe d’autres méthodes permettant d’atteindre un gène donné :

- dans le tilling, on commence par faire des mutations au hasard par mutagénèse chimique, puis on repère les mutations qui affectent le gène d’intérêt, grâce à une enzyme qui reconnait spécifiquement les défauts d'appariement de l'ADN. Les autres mutations sont ensuite éliminées par rétrocroisement. Cette technique est utilisée chez les plantes modèles.

Schéma de principe du tilling. © inra, Patricia Perrot
Schéma de principe du tilling © inra, Patricia Perrot

- l'interférence ARN permet de réduire fortement l’expression d’une protéine : on introduit un petit ARN double brin qui entraîne l’inactivation spécifique d’un ARN messager.

Références sur les méganucléases pour le domaine végétal :

- Shukla V. K. et al. 2009. Precise genome modification in the crop species Zea maysusing zinc-finger nucleases. Nature 459, 437-441 (29 April 2009), doi.10.1038/nature07992.

- Townsend J.A. et al. 2009. High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases. Nature 459, 442-445 (29 April 2009) doi:10.1038/nature07845 Letter.