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Cone de plastique jaune clair dans un bocal au dessus d'une paillasse de laboratoire.. © Bertrand NICOLAS - Inra, NICOLAS Bertrand

 Les biotechnologies vertes, nouvelles pistes pour l’agriculture

ABC des techniques de culture in vitro

Principales techniques de culture in vitro, permettant d'exploiter la diversité et de faciliter les croisements interspécifiques, de diminuer la durée de création des variétés et d'obtenir du matériel végétal sain.

Mis à jour le 31/01/2013
Publié le 18/10/2012

Culture de méristèmes

Culture de méristème (Kalanchoé, plante grasse de la famille des Crassulacées) © MARGARAT J.
Culture de méristème (Kalanchoé, plante grasse de la famille des Crassulacées) © MARGARAT J.
Les méristèmes sont des structures indemnes de virus, dont la culture in vitro permet d'obtenir des plantes saines...
À quoi ça sert ?
La culture de méristèmes a permis, dans les années 50, de guérir des plantes virosées, en particulier chez les plantes qui sont multipliées végétativement : pomme de terre, fraisier, tulipe, etc (Dans le cas de la pomme de terre, les maladies à virus ont entraîné en 1956 la perte de 15 % de la production mondiale, soit 30 millions de tonnes). Cette découverte expérimentale a eu un retentissement considérable et est appliquée aujourd’hui dans le monde entier. En particulier dans les zones tropicales particulièrement sensibles aux épidémies, la culture de méristèmes est la seule technique qui permet de maintenir des productions saines de canne à sucre, de manioc, d’igname ou de bananier.
Comment ça marche ?
Les méristèmes sont formés de cellules non différenciées qui sont présentes dans les bourgeons à l’extrémité des tiges et des racines et qui peuvent, en se multipliant, donner naissance à tous les tissus de la plante. Leur culture permet d'obtenir une plante identique à la plante initiale.
L'intérêt des méristèmes réside dans le fait que ce sont des structures indemnes de virus. Cette découverte fut pressentie au début des années 1950 par deux chercheurs de l’Inra (P. Limasset et P. Cornuet) et confirmée par les travaux de deux autres chercheurs de l’Inra (G. Morel et C. Martin) qui aboutirent, après trois années de travail, à la régénération d’une plante saine (un dalhia) à partir de méristèmes d’une plante contaminée par trois virus.

Culture d’embryons immatures

La technique de culture d'embryons immatures permet d’accélérer les procédures classiques de sélection...
À quoi ça sert ?
La technique de culture d'embryons immatures permet d'éviter la phase de maturation de la graine et d’accélérer les procédures classiques de sélection.
Comment ça marche ?
Les embryons sont prélevés quelques jours après la fécondation et non à maturité de la graine et cela permet ainsi de réaliser plusieurs générations par an. On peut réaliser en une année plusieurs cycles d'autofécondations ou de rétrocroisements successifs nécessaires pour la fixation et la conversion de lignées.
Cette technique est très utilisée chez le tournesol et dans une moindre mesure chez le maïs. Chez le tournesol où les phénomènes de dormance des graines sont particulièrement forts, elle est particulièrement facile à mettre en œuvre, et permet d'obtenir 4 à 5 générations successives par an, au lieu d'une seule en culture normale, car le cycle végétatif est ramené à 80 jours.

La fusion de protoplastes

Protoplastes de tabac. © inra, Georges Pelletier
Protoplastes de tabac © inra, Georges Pelletier

La fusion de protoplastes permet le croisement entre deux espèces éloignées...
À quoi ça sert ?
La fusion de protoplastes permet le croisement entre deux espèces éloignées, quand le sauvetage d’embryons n’est pas suffisant (en cas d’instabilité chromosomique de l’embryon).
Comment ça marche ?
On obtient des protoplastes à partir de cellules végétales dont la paroi a été dégradée par des enzymes. Ces cellules peuvent non seulement fusionner entre elles mais encore régénérer des plantes entières. On retrouve dans les descendants les noyaux et les cytoplasmes des deux parents, à la différence de la reproduction sexuée, où le pollen ne transmet pas son cytoplasme.
C’est ce qu’ont utilisé les chercheurs de l’Inra dans les années 1990 pour transférer le caractère de stérilité mâle cytoplasmique naturel du radis dans le colza, réalisant ainsi une avancée majeure. L’intérêt est d’obtenir des plantes de colza mâle stériles qui permettent la production d’hybrides à l’échelle commerciale chez cette plante qui normalement s’autoféconde. Cette réalisation de l’Inra est à l’origine du développement et de la commercialisation des variétés hybrides de colza en France et dans le monde.

Haplo-diploïdisation

Culture d'anthères d'aubergine. © inra, DUMAS DE VAULX R.
Culture d'anthères d'aubergine © inra, DUMAS DE VAULX R.

La technique d’haplo-diploïdisation permet d'obtenir des lignées pures...
À quoi ça sert ?
La création de lignées pures est une étape nécessaire dans les programmes d'amélioration des plantes. Elle permet de stabiliser les combinaisons génétiques favorables obtenues par sélection. Dans une lignée pure, les plantes sont "homozygotes" pour tous les caractères, c’est-à-dire que les deux lots de chromosomes homologues sont identiques. En sélection classique, on obtient cette "homogénéisation" du génome en réalisant de nombreuses autofécondations.
Comment ça marche ?
On commence par obtenir une plante haploïde par exemple en cultivant des grains de pollen isolés (une plante haploïde ne possède qu’un seul lot de chromosomes). Puis, à partir de ces plantes haploïdes, on peut obtenir des plantes dites "haploïdes doublées", après doublement du stock chromosomique, en utilisant la colchicine.
Ainsi des lignées pures sont produites en quelques mois au lieu de 8 à 10 ans par la méthode classique d'autofécondations.

Multiplication in vitro

Rose en culture in vitro. © MARTIN C.
Rose en culture in vitro. © MARTIN C.

À partir d’un fragment de la plante, on régénère des plantes entières identiques à la plante de départ...
À quoi ça sert ?
La commercialisation d’une variété nécessite de pouvoir la reproduire à l’identique et en grande quantité. La  culture in vitro permet de gagner du temps, de l’espace et des moyens : il ne faut qu’un ou deux ans pour multiplier et mettre sur le marché une nouvelle variété, au lieu de dix à quinze ans en champ ou en serre.
Comment ça marche ?
À partir d’un fragment de la plante, mis en culture dans des milieux complexes appropriés, on régénère des plantes entières identiques à la plante de départ.Depuis 1980, la quasi-totalité des framboisiers cultivés en France proviennent de la multiplication in vitro réalisée dans un laboratoire de l’Inra de Dijon. Le framboisier est une plante très sensible aux virus dont la culture est entièrement dépendante de la production de plants sains, obtenus par la culture in vitro de méristème, partie de la plante épargnée par les virus.
Avec le microbouturage, on peut obtenir 400 000 plants de rosiers par an à partir d’un seul bourgeon. C’est particulièrement intéressant dans le cas du rosier, qui ne peut se semer (car les caractères de couleur, parfum ne sont pas stables génétiquement) et se bouture difficilement. Il fallait donc le multiplier par greffage, pratique lourde qui comporte de plus un handicap physiologique pour la plante.

Sauvetage d’embryons interspécifiques

Pour "sauver" l’embryon, on le prélève quelques jours après la fécondation...
À quoi ça sert ?
À la suite d’une hybridation interspécifique (chou/radis, blé/orge), on peut rencontrer des problèmes d’incompatibilité entre les tissus embryonnaires et les tissus maternels provenant de l’ovule.
Comment ça marche ?
Pour "sauver" l’embryon, on le prélève quelques jours après la fécondation et on le cultive in vitro.
À l’Inra, les chercheurs ont utilisé cette technique pour transférer des caractères agronomiques d’intérêt entre espèces sauvages et cultivées. Ils ont ainsi obtenu des hybrides interspécifiques de courgette (résistant à 2 virus et à l’oïdium), de laitue, d’haricot, de tournesol.
Exemple : le raisin sans pépin DANUTA.