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Microscopie confocale. Cotylédons d’Arabidopsis thaliana ou Arabette des dames (Brassicacées), mutant du cytosquelette : comparaison de l’organisation des plans de division. Coloration des parois des cellules à l’iodure de propidium.. © © INRA, BELCRAM Katia

Microscopie : jusqu’où voit-on ?

zebrafish © fotolia

Dans la queue du poisson zèbre

Observer un poisson vivant au microscope ! Les chercheurs peuvent le faire grâce à des techniques innovantes. Ils visualisent, en temps réel, le comportement des cellules immunitaires en réponse à une lésion cutanée dans la queue d'un poisson zèbre. Ce modèle permettra d’étudier comment cette réponse immunitaire est affectée par une infection virale.

Par Pascale Mollier
Mis à jour le 19/08/2015
Publié le 18/08/2015

L’équipe « Infection et Immunité des poissons » s’intéresse particulièrement à des virus qui sont responsables de dégâts importants dans les élevages de poissons. Ces virus sont connus pour agir directement sur les cellules du système immunitaire, ainsi que sur leurs cellules précurseurs. C’est pourquoi les chercheurs ont développé un modèle qui leur permettra de mesurer l’impact de l’infection virale sur la réaction immunitaire  et inflammatoire.

Ce que montre le film

Le film montre le recrutement de cellules immunitaires sur le site d’une lésion créée dans la queue d’une larve de poisson zèbre de 9 jours. Le poisson, vivant, est recouvert d’un mélange eau/anesthésique/agar qui permet de le maintenir endormi et immobile. La lésion cutanée est induite par un rayon laser qui crée une bulle localement en faisant fondre l’agar, ce qui permet de repérer l’endroit exact de la lésion. Très rapidement, les cellules du système immunitaire : les neutrophiles (marqués en rouge) et les macrophages (marqués en vert) se dirigent sur les lieux de la lésion. Ils sont en charge de l’élimination des cellules de peau abîmée avant la mise en place des mécanismes de régénération (voir encadré). Images accélérées. Durée réelle du phénomène : 4 heures.

Photoablation dans la queue d'une larve de Zebrafish avec un rayon laser.. © Inra, Nam Do Khoa
Photoablation dans la queue d'une larve de Zebrafish avec un rayon laser. © Inra, Nam Do Khoa

L’objectif des travaux : étudier l’impact d’une infection virale sur la réponse immunitaire et inflammatoire

« Nous allons comparer la dynamique de recrutement des cellules immunitaires au site de la lésion chez des poissons infectés ou non par les virus », explique Christelle Langevin. « Nous nous attendons à ce que l’infection virale provoque un dépeuplement des cellules immunitaires mobilisées au site inflammatoire, ce qui affecte la réparation des tissus lésés. Mais encore faut-il le démontrer ! ».

 « Le prochain challenge sera d’observer ce qui se passe chez un poisson adulte dans lequel on peut évaluer d’autres composants du système immunitaire, tels que les lymphocytes B et T, principaux acteurs des mécanismes de protection engagés après vaccination » poursuit Christelle Langevin...Ce qui constitue un nouveau défi puisque les poissons adultes ne sont plus transparents et donc bien plus difficiles à étudier par les approches de microscopie conventionnelles.

Contact(s)
Contact(s) scientifique(s) :

Département(s) associé(s) :
Santé animale
Centre(s) associé(s) :
Jouy-en-Josas

Référence

Levraud JP, Palha N, Langevin C, Boudinot P. Trends Microbiol. 2014 Sep;22(9):490-7. doi: 10.1016/j.tim.2014.04.014. Epub 2014 May 25. PMID: 24865811

Ces travaux sont réalisés dans le cadre de l’infrastructure TEFOR (Transgénèse pour les Etudes Fonctionnelles sur les Organismes modèles), portée par le CNRS en interaction avec l’Inra et l’Inserm. TEFOR fournit des services innovants pour l’édition du génome, la mutagénèse, la transgénèse et le phénotypage par imagerie chez deux organismes modèles : le poisson zèbre et la drosophile. L’infrastructure favorise ainsi l’utilisation de ces modèles en recherche préclinique.

Un challenge technique

Plusieurs défis techniques ont été relevés pour obtenir ces résultats. La survie du poisson dans les conditions expérimentales étant un enjeu majeur, il faut définir des doses d’anesthésiques qui permettent de maintenir le poisson en vie sous le microscope pendant 48h en empêchant les dommages occasionnés par les expositions prolongées aux lasers. Il faut aussi contrôler l’intensité de la lésion, ce qui a été possible en microscopie biphotonique par modulation de la longueur d’onde et de l’intensité des lasers utilisés. Il faut enfin trouver les conditions permettant de visualiser les différentes populations de cellules immunitaires. Pour cela, on crée des poissons transgéniques qui expriment des gènes de protéines fluorescentes (GFP, verte) dans les macrophages et (mCherry, rouge) dans les neutrophiles. L'observation se fait en microscopie confocale.

Pour observer un poisson adulte, qui n’a plus la transparence de la larve, il faut utiliser des approches de microscopie biphotonique, à la fois pour les photoablations et pour les observations, car c'est une approche adaptée pour l’imagerie en profondeur, à la différence des techniques de microscopie confocale, qui conviennent seulement chez la larve pour observer les neutrophiles et les macrophages localisés à la surface dans les tissus.

le Zebrafish, un drôle de zèbre…

Le Zebrafish, ou poisson zèbre, est largement utilisé comme modèle dans les études de développement. Il a l’avantage d’être transparent dans les stades précoces de sa vie. Il possède en outre de remarquables capacités de régénération. Il est capable de régénérer sa nageoire caudale lorsqu’on la coupe, et aussi ses cellules cardiaques, ce qui en fait un bon cheval de bataille pour les chercheurs en médecine…