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Microscopie confocale. Cotylédons d’Arabidopsis thaliana ou Arabette des dames (Brassicacées), mutant du cytosquelette : comparaison de l’organisation des plans de division. Coloration des parois des cellules à l’iodure de propidium.. © © INRA, BELCRAM Katia

Microscopie : jusqu’où voit-on ?

Le grain de blé de A à Z

Plusieurs techniques de pointe de microscopie donnent accès à la structure intime du grain de blé…connaissances précieuses pour fractionner et utiliser au mieux ses différents constituants et pour sélectionner des variétés de blé adaptées à cette microraffinerie du futur.

Par Pascale Mollier
Mis à jour le 22/09/2015
Publié le 21/09/2015

Schéma d'un grain de blé en coupe.. © D'après A. Surget et C. Barron
Schéma d'un grain de blé en coupe. © D'après A. Surget et C. Barron

Tout l’art de la meunerie traditionnelle consiste à séparer l’enveloppe (1) du grain de blé, riche en fibres, de l’amande (2), riche en protéines et en amidon, qui est transformée en farine. Actuellement, on va encore plus loin dans le raffinage et on essaie de séparer chaque composant du grain pour un usage différent : les protéines, l’amidon, mais aussi les lipides pour les huiles, et les fibres, qui peuvent être utilisées comme constituants d’aliments fonctionnels ou de matériaux biosourcés, ou converties en biocarburants. L’avenir sera à la sélection de variétés qui se prêtent à ce fractionnement dans un contexte d’agriculture durable prenant en compte les changements climatiques.  La microscopie apporte sa contribution pour étudier la structure intime du grain de blé, qui détermine ses propriétés et son potentiel de transformation. Du niveau cellulaire au niveau moléculaire, voyage au cœur du grain de blé…

(1) Enveloppe, ou son, formée du péricarpe, du testa, et de la couche aleurone.

(2) Amande, ou albumen ou endosperme.

Microscopie corrélative AFM/Fluorescence des couches périphériques du grain de blé. 1 : Endosperme amylacé (grains d’amidon) ; 2 : Couche aleurone ; 3 : Bande hyaline ; 4 : Testa ; 5 : Cellules tubulaires ; 6 : Cellules transversales ; 7 : Péricarpe externe.. © Inra
Microscopie corrélative AFM/Fluorescence des couches périphériques du grain de blé. 1 : Endosperme amylacé (grains d’amidon) ; 2 : Couche aleurone ; 3 : Bande hyaline ; 4 : Testa ; 5 : Cellules tubulaires ; 6 : Cellules transversales ; 7 : Péricarpe externe. © Inra

Les couches cellulaires vues à différentes échelles

Coupe dans un grain de blé préalablement inclus dans une résine (en vert) : on peut voir (image de gauche) la succession des couches cellulaires marquées en fluorescence. En couplant cette technique à la microscopie à force atomique (AFM, image de droite), on peut « zoomer » fortement sur une zone d’intérêt de l’échantillon, et voir en 3D avec une résolution nanométrique les différents constituants : grains d’amidon et couche de cellules rectangulaires d’aleurone.

Technique : couplage de microscopie à fluorescence et de microscopie à force atomique.

Référence : Berquand A., B. Bouchet and C. Gaillard: Investigating the ultrastructure and mechanical properties of wheat grain tissues using optical microscopy and HarmoniX, Application Note, n°AN122, Veeco Instruments (2008).

Au sein des couches cellulaires : la mesure in situ des forces d’interaction

Image de gauche : fragment de tissu de grain de blé vu en 3D montrant les différentes couches cellulaires caractéristiques (de gauche à droite : péricarpe externe et interne, testa, bande hyaline, couche aleurone et début d’endosperme amylacé avec des grains d’amidon). Agrandissement de la zone des cellules d’aleurone (en vert) et des grains d’amidon (en rouge).Image de droite : cartographie des forces d’adhésions qui se superpose à la zone agrandie de l’image de gauche.. © Inra, Cédric Gaillard
Image de gauche : fragment de tissu de grain de blé vu en 3D montrant les différentes couches cellulaires caractéristiques (de gauche à droite : péricarpe externe et interne, testa, bande hyaline, couche aleurone et début d’endosperme amylacé avec des grains d’amidon). Agrandissement de la zone des cellules d’aleurone (en vert) et des grains d’amidon (en rouge).Image de droite : cartographie des forces d’adhésions qui se superpose à la zone agrandie de l’image de gauche. © Inra, Cédric Gaillard

La microscopie à force atomique donne accès, en plus d’une image très résolue de la structure, à une mesure des propriétés nanomécaniques (élasticité, adhésion, déformation, rigidité) de chaque couche cellulaire. On découvre (image de droite) une grande richesse de nuances des forces d’adhésion mesurées, avec des zones très peu adhésives (en rouge) autour des grains d’amidon et dans la zone aleurone, et des zones plus fortement adhésives (en violet) au niveau des structures internes des grains d’amidon et sur le bord extérieur de la couche aleurone .

Technique : microscopie à force atomique (AFM).

Image STMX d'une zone de l'endoderme amylacé d'un grain de blé.. © Inra, Cédric Gaillard
© Inra, Cédric Gaillard

A l’échelle moléculaire…

L'image ci-dessous correspond à un fragment de l’endoderme du grain de blé, où l’on distingue la forme ovale d’un grain d’amidon (taille environ 20 microns), en bleu, entouré d’une matrice de protéines (en rouge, fausses couleurs). La technique permet donc de distinguer les deux types de biopolymères par leur signature chimique, qui sont pourtant très similaires.

 « Il s’agit d’une technique très analogue à la microscopie électronique à transmission (MET) dans laquelle les électrons sont remplacés par des rayons X « mous », dont la gamme d’énergie ne donne que peu d’absorption par l’eau qui se retrouve transparente, ce qui permet de visualiser seulement la matière organique », explique Cédric Gaillard, qui a adapté cette technique au grain de blé.

Référence  : C. Karunakaran, C.R. Christensen, C. Gaillard, R. Lahlali, L.M. Blair, V. Perumal, S.S Miller, A.P. Hitchcock Introduction of soft X-ray spectromicroscopy as an advanced technique for plant biopolymers research. PLoS One, 2015 26;10 (3) pages: e0122959.

Ce type d’expérience devrait permettre de visualiser les premiers états d’organisation des polymères qui induisent par la suite l’assemblage des structures sub-microscopiques puis cellulaires.

Technique : Microscopie à balayage par transmission de rayons X de synchrotron (STXM) couplé à une technique de spectroscopie (ELNES).

A l’échelle des ions…

Ions dans la couche d'aleurone du grain de blé.Microscopie électronique à balayage (MEB) équipé d’un détecteur à dispersion d’énergie des rayon X (EDX).. © Inra, Cédric Gaillard
Ions dans la couche d'aleurone du grain de blé.Microscopie électronique à balayage (MEB) équipé d’un détecteur à dispersion d’énergie des rayon X (EDX). © Inra, Cédric Gaillard

On peut reconnaitre sur cette image les différentes couches cellulaires, avec toujours les cellules rectangulaires caractéristiques de l’aleurone. La technique (1) permet de détecter la distribution des éléments minéraux, tels que magnésium (Mg), potassium (K) et phosphore (P). On peut ainsi localiser le Mg et le P uniquement dans les cellules d’aleurone, alors que le K se trouve à la fois au niveau des grains minéraux de la couche aleurone et dans les parois. Bien que plus répandue, la microscopie MEB/EDX permet encore de repousser les niveaux d’information accessibles sur le grain de blé.

(1) Technique : Microscopie électronique à balayage (MEB) équipé d’un détecteur à dispersion d’énergie des rayon X (EDX).

L’AFM, une microscopie « en braille »

En AFM, microscopie à force atomique, on mesure les forces d’interaction (hydrophobes, électrostatiques, forces de Van der Waals, liaisons hydrogène) qui s’exercent entre les atomes en surface de l’échantillon et ceux au bout d’une pointe solide (généralement en nitrure de silicium) qui balaie la surface de l’échantillon. Comme le mouvement vertical de la pointe est mesuré en chaque point de la surface, cela permet une lecture topographique de l’échantillon (comme un paysage composé de reliefs et de vallées) mais aussi de mesurer précisément l’intensité très faible des forces d’interactions entre les molécules et la pointe.