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Microscopie confocale. Cotylédons d’Arabidopsis thaliana ou Arabette des dames (Brassicacées), mutant du cytosquelette : comparaison de l’organisation des plans de division. Coloration des parois des cellules à l’iodure de propidium.. © © INRA, BELCRAM Katia

Microscopie : jusqu’où voit-on ?

Les organes reproducteurs de poissons mis à nu

Les gonades de poissons n’auront bientôt plus de secret pour les chercheurs : grâce à des techniques de microscopie innovantes, il est possible d’en observer toutes les cellules, ce qui ouvre des perspectives pionnières pour les études sur la reproduction.

Par Pascale Mollier
Mis à jour le 08/09/2015
Publié le 02/09/2015

Image reconstituée d'un testicule de poisson-zèbre en 3D, vu en microscopie biphotonique associée à une technique de transparisation de l’échantillon. En vert, les cellules de Sertoli, marquées à la GFP. En magenta, les noyaux de toutes les cellules, marqués avec un colorant se liant à l'ADN.. © Inra, Violette Thermes
© Inra, Violette Thermes

Sur cette photo, on peut voir une image de testicule de poisson-zèbre en 3D, reconstituée à partir d’une multitude d’images en 2D (petites images latérales). La technique de microscopie utilisée (1) permet de voir pour la première fois un testicule de poisson en entier dans toute son épaisseur et avec une résolution à l’échelle de la cellule. Les cellules en vert sont des cellules de Sertoli (2), marquées spécifiquement par une protéine fluorescente (la GFP). Tandis que l’iodure de propidium (composé chimique qui se lie à l’ADN) permet de visualiser le noyau de toutes les cellules (en rose).

Des modèles pour étudier la fécondité des poissons

Le poisson-zèbre et le médaka sont des modèles d’étude en biologie de la reproduction, au même titre que les poissons d’élevage comme la truite. Les chercheurs disposent de plusieurs lignées de poissons fluorescents qui permettent de tracer différents types cellulaires : les cellules germinales, qui donnent naissance aux gamètes mâles et femelles, et les cellules de Sertoli. On peut ainsi compter ces cellules et en observer la forme, la taille, la localisation et le comportement en fonction de variations de l’environnement (par exemple la température) ou bien encore dans des mutants. Un des projets de l’unité vise à étudier quand et comment se forment les ovocytes (3) dans l’ovaire. Un autre projet consiste à rechercher des gènes qui ne s’expriment que dans les cellules souches des spermatogonies (4), de façon à pouvoir ensuite marquer spécifiquement ces cellules et les étudier.

(1) Microscopie biphotonique associée à une technique de transparisation de l’échantillon.

(2) Cellules de Sertoli : cellules de la lignée somatique qui entourent les cellules de la lignée germinale organisées en paquets

(3) Ovocytes : cellules de la lignée germinale femelle.

(4) Spermatogonies : cellules de la lignée germinale mâle

Deux espèces modèles

Ces travaux sont réalisés par le TRF (Tefor Rennes Facility), groupe de travail spécialisé dans le phénotypage par imagerie, au sein de l’infrastructure distribuée TEFOR. TEFOR, projet labellisé Investissement d’avenir et coordonné par le CNRS, se focalise sur deux espèces modèles : le poisson zèbre et la drosophile. TEFOR associe des plateformes et des laboratoires experts pour fournir des services innovants et des ressources pour la transgénèse, la mutagenèse et le phénotypage par imagerie.

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La microscopie biphotonique, toujours plus profond

La microscopie biphotonique est une technique de microscopie à balayage laser développée il y a une vingtaine d’années. Elle permet d’aller plus en profondeur que la microscopie confocale  tout en étant  moins délétère pour les tissus.

Alors qu’en microscopie confocale, les molécules fluorescentes n’absorbent qu’un seul photon, en microscopie biphotonique, il y a absorption de deux photons de moindre énergie (infrarouge). L’absorption des deux photons doit se faire simultanément pour qu’il y ait excitation, et cet évènement ne se produit qu’au plan focal. La répétition de l’acquisition dans chaque plan focal permet de reconstituer l’image. Le tissu situé avant le plan focal n’est pas excité, au contraire de la microscopie confocale qui excite le tissu à chaque fois dans toute la profondeur traversée, ce qui peut provoquer une photo-dégradation de l’échantillon.

Rendre les tissus transparents, un défi de taille

Malgré les progrès récents de la microscopie, l’opacité des tissus reste un obstacle majeur à l’observation des organes du poisson adulte qui a perdu la transparence de l’embryon. Les chercheurs ont donc combiné à la microscopie biphotonique une technique innovante qui permet de rendre l’échantillon (ici, un testicule de poisson-zèbre) complètement transparent. Cette technique délicate, qui consiste à  enlever les lipides membranaires, peut prendre une dizaine de jours. Elle a été décrite pour le cerveau dans plusieurs publications de fort impact, mais c’est la première fois qu’elle est adaptée à l’organe génital du poisson.