Détecter des activités enzymatiques : un test qui annonce la couleur…

Un dispositif breveté de détection d'activités enzymatiques a été mis au point. Il se base sur la couleur, propre à l'échelle nanométrique, de films de biopolymères. Rapide, simple et sensible, ce test pourrait être miniaturisé afin d’être intégré dans des dispositifs de criblage haut débit pour des applications en métagénomique, biotechnologies blanches…

détection d'activité enzymatique. © inra
Mis à jour le 22/04/2013
Publié le 18/01/2013

Le principe du test : l’utilisation de couleurs sans colorant

Si la plupart des couleurs que nous observons dans la nature sont liées à la présence de pigments colorés dans l'objet, d'autres n'existent que par une organisation particulière de la matière et son interaction avec la lumière. On les nomme "couleurs structurelles". C'est notamment le cas des plumes de certains perroquets, des ailes de papillon ou des coléoptères...
Les chercheurs du laboratoire BIA ont mis à profit les couleurs structurelles de films de biopolymères à l’échelle nanométrique pour développer un détecteur d’activités enzymatique breveté. Ils ont déposé des films de biopolymères d’une centaine de nanomètres d’épaisseur sur un substrat réfléchissant (silicium), sachant que pour des épaisseurs comprises entre 70 et 200nm, une couleur apparait en raison d’un phénomène d’interférences. Une partie du rayon incident est réfléchie sur l’interface air/film, tandis que l’autre partie est transmise à travers la couche, puis réfléchie sur la deuxième interface film/substrat. Les rayons réfléchis ayant des parcours optiques différents, ils sont en décalage de phase et interfèrent entre eux, provoquant l’apparition d’une couleur. Lorsque l’épaisseur du film change, par exemple suite à la mise en contact avec une enzyme capable de dégrader le biopolymère, la couleur se trouve modulée.

Une détection rapide et simple et sensible

La première étape du test consiste donc à déposer les nanoconstituants par dépôts successifs de manière à contrôler de façon fine l’épaisseur des couches et donc la couleur ainsi qu’à moduler la sensibilité du dispositif. Vient ensuite une phase de quelques minutes de mise en contact du film avec la solution à tester, suivie d’un rinçage et d’un séchage. Immédiatement et sans avoir recours à un appareil de lecture, le verdict tombe : si la couleur est modifiée, c’est qu’il y a bien eu une action enzymatique.

Autre avantage et non des moindres de la méthode, sa sensibilité. Comparée à une méthode colorimétrique classiquement utilisée, le détecteur mis au point est 50 fois plus sensible avec des couches cellulose/xyloglucane et jusqu’à 200 fois plus sensible avec d’autres biopolymères testés (pectines, xylanes, protéines…).

Vers de nouveaux tests de criblage haut débit 

L’objectif est maintenant de développer en collaboration avec des équipes spécialistes des microsystèmes, la miniaturisation des dispositifs et leurs intégrations dans des plaques d’analyse 96 puits, format le plus courant pour le criblage robotisé de banques génomiques compatibles avec tous les automates commerciaux. L’utilisation de cette méthode permettra un criblage rapide et sensible des banques qui sont actuellement en plein développement notamment à travers l’essor de la métagénomique et les enjeux liés aux biotechnologies blanches.

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Illustration avec des films de cellulose et xyloglucane

films nanométriques obtenus par dépôts successifs de cellulose et de xyloglucane.. © inra
films nanométriques obtenus par dépôts successifs de cellulose et de xyloglucane. © inra
Les films nanométriques sont obtenus par dépôts successifs de cellulose et de xyloglucane. La croissance du film est linéaire en fonction du nombre de dépôts (n) et une couleur apparaît après quelques cycles. Les couches sont soumises à l’action de solutions de cellulase possédant différentes activités enzymatiques. Après une incubation de quelques minutes suivie d’un lavage et d’un séchage, la couleur de la couche est modifiée ou disparaît totalement.

En savoir plus

Ce sujet fait l'objet d'un programme ANR qui débutera fin 2011-début 2012 sous l'acronyme Reflex. Il implique l'Institut d'électronique de microélectronique et de nanotechologie de Lille, le LISBP de Toulouse (notamment à travers la plate forme de cribable d'enzyme ICEO) et l'unité BIA de Nantes (coordinateur).

Référence du brevet :

  • Méthode de détection d’activités enzymatiques hydrolytiques sans marquage à base de couches réflectives de biopolymères. Carole Cerclier, Bernard Cathala. Brevet N° FR 1055529 du 7 Juillet 2010

Références bibliographiques :

  • Photonic structures in biology, Vukusic, P.; Sambles, J. R. Nature, (424), (6950), 852-855, 2003.
  • Elaboration of Spin-coated Cellulose-Xyloglucan Multilayered Thin Films, Carole Cerclier, Fabrice Cousin, Hervé Bizot, Céline Moreau and Bernard Cathala, Langmuir, 26 (22), pp 17248–1725, 2010.
  • Coloured Semi-reflective Thin Films for Biomass-hydrolyzing Enzyme Detection. Cerclier C., Lack-Guyomard A., Moreau C., Cousin F., Beury N., Bonnin E, Jean B., Cathala B. (2011) Advanced Materials 23: 3791–3795