Proposition de programme de recherche et utilité des animaux à flore contrôlée pour estimer les risques
Les industries agro-alimentaires utilisatrices de bactéries vivantes
et tout particulièrement celles qui utilisent des ferments lactiques
vont, dans un avenir désormais proche, proposer sur le marché
des bactéries modifiées par les techniques du génie
génétique. Les gènes modifiés sont placés
soit directement sur le chromosome des bactéries, soit portés
sur des molécules d'ADN extra-chromosomiques, le plus souvent des
plasmides. Ces bactéries modifiées en vue d'améliorer
leur efficacité technologique vont naturellement être
ingérées en grande quantité par le consommateur avec
le produit fermenté : la consommation d'un pot de yaourt entraîne
l'ingestion d'environ 100 milliards de lactobacilles et de streptocoques.
Les bactéries vivantes ainsi ingérées vont transiter
à travers l'estomac et l'intestin grêle du consommateur, y survivre
plus ou moins longtemps, se mêler aux bactéries de la flore
autochtone dans le gros intestin et, avec les fèces, être
rejetées dans l'environnement.
Le remplacement des ferments traditionnels par des microorganismes à
ADN recombiné pose des questions de deux ordres :
- impact toxicologique de ces bactéries sur le consommateur,
c'est-à-dire le risque de voir apparaître directement un effet
pathogène pour l'hôte ;
- impact écologique sur l'écosystéme de sa flore
intestinale, c'est-à-dire le risque de voir apparaître des
bouleversements considérables de la flore du tube digestif se traduisant
dans un second temps par des effets nocifs pour l'hôte.
Nous allons tenter d'examiner dans les deux cas la nature et l'étendue
des risques et de voir comment l'utilisation d'animaux gnotoxéniques
(littéralement : associés uniquement à des microorganismes
connus), à flore totalement contrôlée et
élevés dans des isolateurs clos, peut amener des
éléments de réponse.
C'est à l'heure actuelle sûrement le moins préoccupant
des deux types de risque envisagés dans le cas des ferments utilisés
par l'industrie agro-alimentaire. Le risque de transformer ces ferments en
bactéries directement pathogènes pour l'homme semble a
priori nul puisque ni le génôme de ces bactéries,
ni le fragment d'ADN qu'on y insère ne porte de déterminant
de pathogénicité.
Par ailleurs de nombreuses techniques classiques permettent d'apprécier
la pathogénicité d'une souche bactérienne et peuvent
être appliquées ici même si cette pathogénicité
est hautement improbable : mesure de cytotoxicité in vitro,
de dose léthale 502 sur des animaux de laboratoire, etc.
L'animal gnotoxénique peut aussi constituer un élément
supplémentaire important dans l'appréciation de la toxicité
potentielle dans le tube digestif. Il est en effet souvent impossible
d'apprécier la toxicité potentielle d'une souche bactérienne
en la faisant ingérer à un animal porteur d'une flore microbienne
complexe dans son tube digestif (animal holoxénique : c'est-à-dire
associé sans contrôle à tous les microorganismes
capables de peupler l'écosystème). En effet, la souche
ingérée est alors éliminée par la flore autochtone
sans atteindre un développement suffisant in situ pour exprimer
sa pathogénicité.
Par contre, si on l'ensemence seule chez un animal axénique (totalement
dépourvu de microorganismes), elle se développe le plus souvent
et atteint un niveau élevé et stable où elle peut alors
exercer son effet pathogène. C'est ainsi que certaines souches de
Clostridium difficile, pourtant productrices d'une entérotoxine
redoutable pour l'homme, sont inoffensives quand on les fait ingérer
à des animaux holoxéniques, mais tuent en 48 heures tous les
animaux axéniques chez lesquels elles se multiplient
(4).
L'ensemencement d'un microorganisme à ADN recombiné chez des
animaux axéniques dont on observera la morbidité et la
mortalité constitue donc un élément d'appréciation
important de l'inocuité d'une bactérie destinée à
être ingérée.
Remarquons enfin qu'une bactérie incapable de s'implanter chez un
animal axénique (pour des raisons d'inadéquation des conditions
physico-chimiques régnant dans le tube digestif) ne peut guère
être soupçonnée d'avoir un effet sur l'hôte.
L'impact sur l'écosystème de la flore du tube digestif
Quelques rappels concernant i'écosystème microbien du tube
digestif
La population microbienne qui vit dans les cavités du tube digestif
est sûrement une des plus denses qui existe sur terre : environ 1 014
bactéries viables sont présentes dans le tube digestif d'un
homme, soit environ 10 bactéries pour une cellule dont est constitué
le corps de cet homme. Ces bactéries sont essentiellement localisées
dans les segments distaux du tube digestif : iléum, caecum, colon.
Au contraire, les segments proximaux de l'instestin grêle sont presque
dépourvus de bactéries et la flore stomacale, surtout chez
l'homme, est quantitativement faible. on distingue dans la flore du gros
intestin une flore dominante, constituée de bactéries
anaérobies strictes, souvent tuées par un contact de quelques
minutes avec l'oxygène de l'air, et dont les populations atteignent
des valeurs de l'ordre de 10. à 1011 bactéries par gramme de
contenu. Seules ces populations de bactéries dominantes peuvent avoir
un impact positif ou négatif sur l'hôte. Les populations de
bactéries sous-dominantes, réprimées par les
précédentes ne dépassent pas 107 bactéries par
gramme de contenu et sont alors incapables d'exercer leur effet sur l'hôte.
Par contre à la moindre rupture des barrières qui les
répriment elles peuvent apparaître dans la flore dominante et
exercer leurs actions sur l'hôte. Enfin, de nombreuses bactéries
ingérées par l'hôte, en particulier avec sa nourriture,
ne font que transiter dans le tube digestif sans s'y multiplier.
La flore microbienne du tube digestif joue deux rôles importants pour
l'hôte qui l'abrite. Tout d'abord cette flore exerce un effet de
barrière extrêmement puissant à l'égard de la
plupart des bactéries de l'environnement qui pénètrent
dans l'écosystème et en particulier à l'égard
des espèces potentiellement pathogènes. Par ailleurs, la flore
métabolise les fractions indigestibles de l'aliment et les
sécrétions digestives de l'hôte et déverse dans
la lumière du tube digestif les produits de ce métabolisme
: elle est ainsi capable d'agir sur de nombreuses fonctions physiologiques
de l'hôte, en particulier celles qui sont liées à la
sphère digestive (6)
.
Souvent les écologistes traditionnels focalisés sur la nature
des organismes constituant les écosystèmes, émettent
l 'opinion que tout changement important dans la taille des populations ou
la structure des communautés d'un écosystéme, en relation
directe avec l'arrivée d'un matériel étranger, doit
a priori et en soi, être considéré comme un effet
nuisible (2). Dans le cas de
l'écosystème microbien du tube digestif, on peut craindre surtout
que les fonctions de l'écosystéme soient modifiées par
l'arrivée de microorganismes étrangers et que ce
déséquilibre se traduise par des effets pathologiques pour
l'hôte.
Une situation de déséquilibre particulier de la flore du tube
digestif a été très étudiée : celle qui
résulte de l'ingestion d'antibiotiques. Sa manifestation la plus
spectaculaire est la disparition de nombreux effets de barrière dus
à la flore dominante et l'apparition dans celle-ci de bactéries
pathogènes jusque là réprimées, dont l'effet
peut aller du déclenchement de diarrhées bénignes à
la mort due à une entérocolite nécrosante. Mais d'autres
effets indésirables peuvent aussi être observés au niveau
physiologique : action sur le transit digestif, sécrétion de
molécules potentiellement carcinogènes, transformation de
substances inoffensives venant de l'aliment en substances ayant un effet
néfaste sur l'hôte, modification d'activité de certains
médicaments, ...
A la question de savoir si des modifications de l'équilibre de
l'écosystéme sont susceptibles d'avoir un effet nocif sur
l'hôte, on peut donc objectivement répondre oui.
Les effets de barrière rendent difficile l'établissement en
nombre élevé de bactéries exogénes dans le tube
digestif. Cependant, ces effets peuvent parfois disparaître soit
spontanément, soit plus souvent à la suite de perturbations
extérieures comme l'ingestion d'antibiotiques ou de modifications
importantes du régime alimentaire : c'est ainsi par exemple que l'on
explique la survenue des diarrhées du voyageur dans des pays où
la probabilité d'ingérer des entérobactéries
pathogènes est très élevée et les habitudes
alimentaires des voyageurs très perturbées.
Enfin, il faut bien dire que l'on ignore tout des caractéristiques
génétiques susceptibles de donner "un avantage écologique"
à une souche bactérienne donnée et de lui permettre
ainsi de s'installer dans la flore dominante. on peut toujours craindre de
voir des gènes codant pour de tels caractères, présents
dans une souche ingérée sans qu'on ait pu les mettre en
évidence auparavant.
Il existe une autre possibilité pour les bactéries
ingérées, même si elles ne s'établissent pas,
de modifier l'écosystème microbien du tube digestif : c'est
le transfert de caractères génétiques aux souches
résidentes par les souches exogénes en transit. Une telle
possibilité a déjà été démontrée
"in vivo" pour les bactéries porteuses de plasmides codant
pour des caractères de résistance aux
antibiotiques (7). Même si il semble
que souvent, en l'absence de pression de sélection par les antibiotiques,
les souches porteuses de plasmides restent, dans le tube digestif,
réprimées par les souches qui en sont dépourvues, ce
n'est pas général ; d'autres facteurs écologiques entrent
en compte pour modeler l'équilibre.
Par ailleurs et sur le plan expérimental, on constate que les
équilibres obtenus "in vitro", même en culture continue,
avec les mêmes souches ne reflètent pas toujours l'équilibre
qu'on observe "in vivo".
Les expériences faites dans ce domaine à l'aide d'animaux à
flore contrôlée sont encore peu nombreuses et ne permettent
pas, en particulier, de savoir si la nature des vecteurs génétiques
portés par les bactéries joue un grand rôle dans le transfert
d'un caractère "in vivo" : un caractère porté
par un plasmide conjugatif (c'est-à-dire intervenant dans le
mécanisme de conjugaison inter-individuel, à la base
d'échanges de matériel génétique entre
bactéries) se transmet-il plus facilement dans l'écosystème
digestif ? Peut-on avoir des passages "in vivo" des bactéries
à Gram positif aux bactéries à Gram
négatif (a) ? Autant de questions dont la
réponse nécessite des expérimentations.
La nécessité d'expérimenter "in vivo" pour
déterminer l'impact sur l'écosystème microbien du tube
digestif d'une souche bactérienne à ADN recombiné est
évidente.
Tout d'abord, il existe des bactéries de l'écosystéme
que l'on ne sait pas cultiver "in vitro", mais que l'on détecte
"in vivo" par leurs fonctions.
Comme pour tous les écosystèmes bactériens, les
équilibres que l'on obtient en cultivant des souches de
l'écosystème "in vitro" ne reproduisent généralement
pas les équilibres existant "in vivo" : ainsi, on a pu observer
qu'entre deux bactéries isogéniques, ne différant que
par la présence chez l'une d'un plasmide codant pour la résistance
à la tétracyline (un antibiotique), l'équilibre
s'établit en culture continue en faveur de la souche sans plasmides
alors que l'on observe l'inverse "in vivo" chez des animaux
gnotoxéniques (3).
Un autre exemple illustre la difficulté de prévoir le comportement
"in vivo" de bactéries exogènes. on utilise pour obtenir
un "confinement biologique", des souches d'E. coli réceptrices
d'ADN étranger qui sont exigeantes en acide diaminopimélique
(DAP), substance uniquement d'origine bactérienne et peu répandue
dans l'environnement. on a pu montrer à l'aide de modèles
gnotoxéniques que les parois de certaines bactéries de la flore
du tube digestif pouvaient servir de source de DAP aux mutants exigeants
et permettre leur croissance "in vivo". En revanche, le DAP présent
dans les parois d'autres bactéries n'est pas utilisé comme
substrat par ces mutants (5).
L'outil de choix pour les études d'impact sur l'écosystème
bactérien est donc l'animal gnotoxénique c'est-à-dire
l'animal axénique associé à une flore contrôlée
et élevée dans une enceinte étanche à l'environnement
microbien, appelée isolateur. on constitue ainsi un véritable
microcosme, c'est-à-dire une fraction minime d'écosystème
complètement isolée de l'environnement extérieur et
dans lequel on peut expérimenter dans des conditions proches de la
réalité. Le recours au microcosme est d'ailleurs recommandé
dans le cas des autres écosystèmes bactériens de
l'environnement comme l'eau ou le sol
(8).
L'intérêt de l'utilisation d'animaux gnotoxéniques vient
d'abord des conditions de sécurité dans lesquelles on peut
expérimenter. La souche à tester n'est introduite que dans
une enceinte dont l'étanchéité par rapport à
l'environnement bactérien peut être contrôlée
facilement, en vérifiant au départ la stérilité
des animaux axéniques qui y sont placés. En cas de danger lié
à la souche testée, l'intérieur de l'isolateur peut
facilement être stérilisé à tout moment. Notons
à ce propos que contrairement au cas où l'on cherche à
déterminer la toxicité de molécules chimiques,
l'expérimentation à l'échelle pilote est certainement
à proscrire pour mesurer les risques liés à l'utilisation
d'un organisme autoreproducteur comme une bactérie. En effet, il est
impossible d'empêcher une population bactérienne, même
répartie sur une surface faible ou dans une population humaine ou
animale limitée, de ne pas se répandre dans l'environnement,
surtout, précisément, si elle est capable de bouleverser les
systèmes régulateurs des écosystèmes. Quand on
aura reconnu le danger, il sera alors trop tard pour arrêter l'expansion
de la population. L'utilisation de microcosmes complètement
hermétiques est donc la seule alternative possible.
Un autre intérêt de l'utilisation des animaux gnotoxéniques
est la possibilité d'expérimenter soit dans des situations
écologiques artificielles permettant d'apprécier les
potentialités maximales de dissémination, soit dans des situations
proches de la réalité : ainsi il est possible d'ensemencer
chez des souris axéniques des flores fécales humaines et on
a démontré que l'équilibre qui s'établissait
chez les souris était très proche de celui qui existait chez
le donneur. on peut dés lors apprécier sans danger l'impact
écologique d'une souche ingérée sur la flore d'un
consommateur humain.
Bien entendu, comme dans tous les écosystèmes, l'étude
de la diffusion d'une bactérie à ADN recombiné dans
la population complexe du tube digestif dépend de la présence
de marqueurs phénotypiques plus ou moins facilement identifiables
ou de la possibilité de reconnaître le fragment d'ADN
intégré (sondes d'ADN, par exemple).
Finalement, on pourrait suggérer pour tester les risques liés
à l'ingestion de bactéries à ADN modifié par
le consommateur, les étapes suivantes qui pourraient être largement
modulées en fonction des caractères portés par l'ADN
utilisé, du type de vecteurs et aussi de l'utilisation technologique
de la souche :
- Etude de la morbidité et de la mortalité chez les animaux
axéniques monoassociés à la souche transformée.
Etude de sa stabilité génétique de la souche "in
vivo" ;
- Etude de l'équilibre et du transfert de l'ADN exogéne entre
la souche modifiée et la souche primitive chez des animaux
dixéniques (associés à ces deux souches) ;
- Etude de l'équilibre et des possibilités de transfert entre
la souche transformée et la souche dominante la plus proche
taxonomiquement (même espèce par exemple) présente dans
la flore humaine ;
- Chez des animaux gnotoxéniques associés à une flore
complexe, étude de la survie et du transit de la souche modifiée,
étude du transfert d'ADN à la flore dominante, étude
de l'équilibre de la flore dominante après ingestion de la
souche modifiée.
Ce type d'étude n'ayant jamais été réalisé
complètement sur des souches modifiées d'intérêt
industriel, il est très probable que l'expérience amènera
à modifier et sans doute à simplifier les propositions ci-dessus,
pour définir les tests les plus importants réalisables dans
la pratique.
[R] Note
(a) Bactéries Gram+ : groupe
de germes bactériens possédant une paroi dont la structure
chimique permet de fixer le colorant bleu de Gram.
Bactéries Gram- : groupe de bactéries dont la paroi a une structure
différente ne fixant pas le colorant de Gram. [VU]
(1).Andremont A. , Raibaud P. , Tancrede C. , Duval-Iflah Y. and Ducluzeau
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(2). Cairns J. and Pratt J.R. . Ecological consequence assessment
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p. 171-182a. [VU]
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R-plasmid selection : are in vitro methods good models ? Zbl Bakt. Hyg. 1987,
A264, p. 178-184. [VU]
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(5). Ducluzeau R. , Ladire H. , Raibaud P. . Implantation
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(8). Gillett J.V. . Risk assessment methodologies for
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