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2. GENOMIQUE ET AMELIORATION DES PLANTES

Depuis la préhistoire, les espèces cultivées ont été modelées en fonction des besoins et des intérêts de l’Homme. Pendant des millénaires, cela s’est traduit par une sélection inconsciente et artisanale des caractères favorables (et donc des gènes qui les gouvernent). Depuis seulement quelques décennies, l’amélioration des plantes est une activité scientifique basée d’abord sur une exploitation de la variabilité génétique naturelle, et depuis peu sur la connaissance croissante du fonctionnement du génome des plantes dans leur environnement.

2.1. Domestication et sélection

L’homme a toujours cherché, de façon empirique et bien avant de connaître les lois de l’hérédité, à domestiquer et améliorer les végétaux qu’il consommait en sélectionnant les plantes les mieux adaptées à ses besoins. Par exemple en découvrant et multipliant une plante de blé dont les grains ne tombaient pas spontanément sur le sol à maturité, il a sélectionné un mutant affecté dans le ou les quelques gènes contrôlant ce caractère d’égrenage. C’est une erreur dans la duplication de l’ADN qui a pu provoquer cette nouvelle caractéristique, héréditaire si elle touche les cellules reproductrices. C’est l’apparition naturelle d’un nouveau « mutant ». Une telle plante mutante livrée à elle-même dans un environnement naturel n’a aucune chance de se maintenir dans la population de plantes sauvages puisque toutes les graines de son épi vont germer au même endroit, créant une situation de compétition très forte pour le développement des plantules. Elle aura moins de descendants que la plante non mutante qui sera, elle, capable de disséminer ses graines sur des distances beaucoup plus importantes. Pour l’homme, en revanche, l’apparition suivie du choix et de l’utilisation d’un tel mutant a été déterminante puisqu’elle lui a permis de multiplier des plantes de blé dont la récolte des grains était grandement facilitée.

Cette façon empirique de domestiquer les végétaux en puisant dans la diversité spontanée des différentes espèces, ayant pour origine des événements naturels de mutations, de recombinaisons, d’insertions ou de réarrangements structuraux dans le matériel génétique, s’est poursuivie jusqu’à la découverte des lois fondamentales de l’hérédité. La compréhension des mécanismes de transmission des caractères a permis à l’homme de cumuler d’une façon beaucoup plus efficace les caractères agronomiques les plus intéressants dans les variétés qu’il cultivait.

Photo J.-M. Bossennec © INRA

Mutant de pois afila. Les feuilles sont remplacées par des vrilles. Il ne reste que les stipules, à l’insertion des vrilles.

Très schématiquement, le sélectionneur qui vise à améliorer une variété pour un caractère donné (résistance à un pathogène par exemple ou tout autre caractère qualitatif) va tout d’abord rechercher une plante de la même espèce, cultivée ou sauvage, possédant ce caractère puis l’introduire par croisement dans la variété cultivée. A partir de l’hybride obtenu, il entreprend ensuite une série de croisements avec la variété cultivée et sélectionne dans les descendances successives les plantes qui possèdent à la fois les qualités de la variété de départ et le caractère nouveau.

Cette façon de procéder est tout à fait classique et concerne toutes les espèces cultivées. On peut donner l’exemple du pois, espèce modèle en génétique depuis les travaux de Mendel, où de nombreuses mutations modifiant l’architecture et la morphologie de la plante ont été identifiées. Ces mutations sont apparues la plupart du temps spontanément dans diverses populations mais on a pu aussi, dans certains cas, augmenter leur fréquence d’apparition par des traitements mutagènes particuliers (traitements chimiques, rayonnements ionisants). Chez des espèces sélectionnées depuis relativement peu de temps comme le pois protéagineux destiné à l’alimentation animale, des progrès génétiques importants et rapides ont été obtenus par l’utilisation de telles mutations à effets majeurs. On peut citer l’exemple des mutations le (nanisme) ou afila (modification des folioles en vrilles) qui ont, entre autres, considérablement amélioré la résistance du pois à la verse (plantes couchées sur le sol et impossibles à récolter). Le gène muté le se distingue du gène sauvage Le, codant pour une enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse des gibérellines (hormones végétales nécessaires à la croissance des plantes), par un changement d’un seul nucléotide dans sa séquence, ce qui conduit à la réduction considérable de l’efficacité de l’enzyme produite dans le mutant nain. Plus petit, il verse moins.

Depuis toujours le croisement spontané entre espèces différentes et les échanges d’informations génétiques en résultant ont contribué à l’évolution des plantes. De nombreuses espèces actuelles proviennent d’hybridations naturelles (ou de croisements) entre des espèces différentes. Les génomes du blé et du colza sont par exemple constitués de la totalité des chromosomes de leurs espèces parentales. Il est également possible de transférer par croisement des caractères agronomiques portés par un fragment de chromosome d’une espèce à une autre, à condition qu’elles soient apparentées entre elles. L’introduction d’un caractère particulier d’une espèce dans une autre après le croisement repose uniquement sur les possibilités de recombinaisons méiotiques. On ne transfère donc pas un seul gène, mais un fragment chromosomique portant le gène considéré ainsi que plusieurs dizaines, centaines ou milliers d’autres.
Chez la tomate, très sensible à des maladies parasitaires d’origine fongique, bactérienne ou virale, une bonne trentaine de gènes de résistance à des pathogènes variés, issus d’espèces non comestibles de la même famille que la tomate, ont ainsi été transférés par croisement depuis des dizaines d’années. On peut calculer par exemple que pour la tomate cultivée, après 10 cycles de croisements successifs avec la variété de départ, il reste théoriquement dans le génome de la nouvelle variété un fragment d’ADN de l’espèce sauvage d’au moins 350 000 nucléotides. Ce fragment contient bien sûr le gène qui a fait l’objet de la sélection, mais celui-ci représente rarement plus d’une dizaine de milliers de nucléotides. On a très peu d’information sur la structure moléculaire de ces “introgressions” de l’espèce sauvage dans l’espèce cultivée, en dehors du fait qu’elles contiennent le gène conférant la résistance au pathogène choisi et sans doute de nombreux autres gènes dont on ne connaît rien. Le recours à la transgénèse, s’il est un jour accepté par la société, permettra de n’insérer que l’information génétique nécessaire à l’expression du caractère amélioré et donc de mieux maîtriser les conséquences du croisement.

2.2. Connaissance et gestion de la biodiversité

L’utilisation de la diversité existante des caractères de chaque individu, leur variabilité, est un principe majeur de l’amélioration des plantes. De nos jours, la connaissance des ressources génétiques, qu’il s’agisse des espèces sauvages ou des espèces cultivées, des variétés anciennes ou récemment créées par l’homme, est un enjeu considérable. Dans ce contexte, il est nécessaire de disposer d’une variabilité génétique large, qu’il faut collecter, caractériser, conserver et gérer. La caractérisation de la variabilité passe par la description et l’inventaire de l’ensemble des caractères des plantes, qu’ils soient visibles (comme la taille de l’épi, la couleur du grain…) ou invisibles (marqueurs moléculaires).
Par exemple, l’INRA est associé depuis 1983 à un programme de recherche sur les ressources génétiques du maïs. Les objectifs du programme sont, à partir du plus grand nombre possible de populations de maïs, de caractériser leur variabilité et de définir des stratégies de conservation et de gestion de cette variabilité, afin de pouvoir l’utiliser en sélection. La collection rassemble 1200 populations de maïs, dont 270 populations françaises, des populations d’Argentine et du Chili n’ayant jamais été croisées avec des variétés modernes, et des populations issues de programmes de sélection. La biodiversité est étudiée à partir de caractères agro-morphologiques tels que la précocité de floraison, la taille de la plante, les caractéristiques de l’épi (longueur, largeur, diamètre) et du grain (couleur, texture…) mais également à l’aide d’outils d’analyse du polymorphisme de l’ADN.
L’analyse de la variabilité de l’ADN de 65 populations différentes a mis en évidence des différences par groupes d’origines géographiques différentes. Elle confirme la séparation déjà connue entre les populations européennes et américaines, et permet une distinction nette entre les populations d’Europe de l’Est d’une part, et celles d’Europe de l’Ouest et du Sud d’autre part. Elle montre que les populations françaises ont vraisemblablement des origines espagnole et italienne. Enfin, elle révèle que la présence en Europe de l’Est de populations proches du matériel américain résulte probablement d’introductions de maïs datant du XIXème ou début du XXème siècle. L’étude du polymorphisme de l’ADN permet donc de retracer la généalogie des différentes populations de maïs. Ce type d’études est indispensable pour constituer des collections représentatives de la variabilité d’une espèce qui serviront de réservoirs de gènes aux générations futures.

2.3. Sélection assistée par marqueurs

La Sélection Assistée par Marqueurs (SAM) utilise les données de la génomique pour améliorer l’efficacité du processus de sélection et réduire sa durée. Les méthodes classiques de sélection nécessitent le plus souvent d’attendre le stade adulte des plantes issues d’un croisement pour identifier les plantes porteuses des caractères intéressants (taille de la plante, de l’épi, qualité de la graine…). Par ailleurs, la détection de certains caractères nécessite la mise en oeuvre de tests lourds (composition biochimique des graines, résistance aux maladies).
Certains caractères sont gouvernés pas l’action d’un seul gène et sont dits de type “qualitatifs” (présence ou absence). Les caractères de ce type sont transmis de façon simple dans la descendance de croisements, puisqu’il suffit que le gène responsable soit transmis à une plante pour qu’elle ait le caractère désiré. Même si le gène responsable d’un caractère intéressant n’est pas identifié, il peut être localisé sur une carte génétique, et encadré par des marqueurs moléculaires.

D’autres caractères correspondent à la combinaison de l’action de plusieurs gènes et sont dits “quantitatifs” : le rendement ou la hauteur des individus peuvent ainsi prendre toutes les valeurs entre deux extrêmes. Les régions chromosomiques impliquées dans ces caractères quantitatifs (QTL : Quantitative Trait Loci) peuvent être localisées sur une carte génétique à l’aide de méthodes statistiques, et repérées par des marqueurs moléculaires. Ce travail est réalisé en étudiant la transmission conjointe des caractères et de marqueurs moléculaires dans la descendance d’un croisement. Lorsque les QTL sont identifiés le sélectionneur peut repérer les plantes intéressantes dans la descendance d’un croisement en se basant sur la présence des marqueurs moléculaires proches des gènes contrôlant les caractères recherchés. Les marqueurs moléculaires présentent l’avantage de pouvoir être détectés facilement et d’être visualisables à partir d’échantillons d’ADN extraits de plantes très jeunes. La SAM permet ainsi dans certains cas de réduire de moitié la durée de la sélection de nouvelles variétés : de 10 ans pour le colza par exemple, on passe à 4-5 ans pour la sélection de variétés améliorées pour la qualité, dans la mesure où la sélection peut se faire en conditions artificielles à raison de deux générations de sélection par an, au lieu d’une génération au champ.

A titre d’exemple, un programme européen, débuté en janvier 1998 et prévu sur quatre ans, est en cours pour obtenir par « sélection assistée par marqueur », grâce aux nouvelles connaissances et techniques, des pommiers résistants de manière durable à deux maladies : l’oïdium et la tavelure. Il s’agit d’une part d’identifier parmi les variétés conservées dans plusieurs collections de pommiers, dont le Conservatoire du centre INRA d’Angers, de nouvelles sources de résistance et d’estimer leur durabilité. D’autre part, les régions chromosomiques impliquées dans la résistance sont balisées par des marqueurs moléculaires. La variabilité du pathogène (différentes races, agressivité variable) est prise en compte dans cette étude pour identifier les régions spécifiques d’une race et les régions conférant une résistance à spectre large. A terme, l’objectif est de cumuler les régions à spectre large et certaines régions spécifiques dans des nouvelles variétés pour obtenir un niveau de résistance satisfaisant et durable. Des résistances fortes monogéniques peuvent masquer des résistances partielles mais éventuellement plus durables dans des tests réalisés en vergers ou en serre. L’utilisation de marqueurs moléculaires, sans lesquels ce travail n’aurait jamais pu être envisagé, permet de suivre dans une descendance de croisement toutes les régions chromosomiques impliquées dans la résistance et de sélectionner les plantes contenant le plus grand nombre possible de gènes de résistance, tant les gènes majeurs que les gènes de résistance partielle.

2.4. Création de plantes transgéniques améliorées

Nous avons vu comment on pouvait transférer, par croisements et sélections successifs, des gènes conférant des caractères d’intérêt agronomique dans une variété. Cette façon de procéder, même si elle a fait ses preuves, n’est pas dénuée dans certains cas d’inconvénients. Tout d’abord, on ne transfère pas seulement le gène choisi mais un grand nombre d’autres gènes de fonction non identifiée. A cela peuvent s’ajouter les problèmes de stabilité des chromosomes engendrés par des introgressions de taille trop importantes. Dans bon nombre de cas encore, des caractères plus ou moins indésirables sont liés au gène gouvernant le caractère recherché. Il est alors très difficile de s’en débarrasser et les programmes d’amélioration ne peuvent pas aboutir.

Le transfert de gène consiste, lui, à introduire une information génétique nouvelle, déterminée et connue par sa séquence d’ADN, dans le génome des cellules d’une plante. Le processus dans ce cas est différent : au lieu de “mélanger” les informations génétiques de deux plantes et de “trier” dans les descendants de cet hybride les plantes possédant le caractère recherché, on introduit seulement le gène conférant le caractère intéressant dans la variété de départ. Le grand avantage est qu’il est ainsi possible d’introduire un gène isolé d’une espèce très éloignée et lui seulement. En contrepartie, il faut avoir au préalable isolé et caractérisé le gène responsable du caractère recherché, ce qui n’est pas nécessaire lorsqu’on utilise les méthodes classiques d’amélioration des plantes. De plus ces approches sont encore difficilement envisageables lorsque le caractère à introduire est contrôlé par plusieurs gènes.

Les plantes obtenues par transgénèse diffèrent donc essentiellement des plantes pour lesquelles un caractère a été introgressé par reproduction sexuée par la connaissance précise de l’information génétique ajoutée ainsi que par la nature de cette information qui n’est plus nécessairement limitée aux espèces proches.

Il est ainsi possible de faire exprimer chez une plante un gène conférant un caractère particulier issu d’une espèce d’un autre règne (animaux, bactéries). De nombreux exemples sont déjà connus, comme certains gènes de résistance à des herbicides ou à des insectes, originaires de bactéries. Des études sont actuellement en cours pour faire produire par des plantes des molécules pharmaceutiques de diverses origines difficiles ou coûteuses à produire par d’autres méthodes ou dans des conditions de sécurité satisfaisantes (vaccins, polypeptides à usage médical etc.).

Plantes transgéniques et réglementation En raison de la nouveauté des procédés mis en oeuvre, mais surtout de la rapidité avec laquelle le génie génétique permet de créer des caractéristiques nouvelles, l’utilisation des organismes trangéniques est réglementée. En Europe ce sont deux directives, et leurs traductions pour les différents états membres, qui régissent l’utilisation du génie génétique des premières étapes de laboratoire jusqu’à l’éventuelle mise en culture. Les utilisations en laboratoire sont soumises au régime de l’agrément par le ministre en charge de la recherche, et par le ministre en charge de l’environnement, sur l’avis de la commission de Génie Génétique. Ensuite les expérimentations en plein champ doivent être autorisées par le ministre en charge de l’agriculture, et par le ministre en charge de l’environnement, sur avis de la commission du Génie Biomoléculaire. Cette commission préconise au cas par cas des contraintes d’isolement biologique ou géographique de façon à minimiser les impacts éventuels de ces expérimentations. Les procédures d’autorisations de mise en marché, pour l’importation de produits dérivés de plantes transgéniques ainsi que pour l’autorisation de culture, reposent sur les avis de l’ensemble des comités d’experts européens après l’analyse de l’ensemble des éléments disponibles sur la composition des produits et leur innocuité (toxicité, allergénicité...). Voir le site officiel du gouvernement : http://www.finances.gouv.fr/ogm

2.5. Connaissance du fonctionnement des végétaux

La variabilité génétique existante au sein de l’espèce et de ses apparentées constitue la base de travail du sélectionneur. Cependant, tout aussi cruciale est sa connaissance de la plante, de sa physiologie et de ses réponses aux différentes contraintes imposées par le milieu. Le travail de sélection, qui porte souvent sur un grand nombre de caractères complexes en interaction, repose donc dans une large mesure sur les connaissances de base acquises dans les disciplines fondamentales. Ces connaissances permettent d’aborder de façon plus efficace et raisonnée les stratégies d’amélioration des plantes cultivées. Dans cette optique, l’INRA a défini des cibles prioritaires et développe de nombreux programmes de recherche fondamentale, dans des domaines aussi divers que la biologie du développement, la physiologie et la biochimie végétale, ou encore la pathologie végétale. La génomique fonctionnelle, par la puissance des outils qu’elle apporte, permet un gain considérable de précision et d’efficacité pour l’étude de ces problèmes.

2.5.1. Identification des gènes et de leurs fonctions

• Un exemple de mutagenèse insertionnelle : les gènes impliqués dans la synthèse de cellulose chez Arabidopsis. La mutagenèse insertionnelle consiste à provoquer une mutation par l’insertion dans un gène d’un nouveau fragment d’ADN.
Les collections de mutants permettent en principe d’identifier tous les gènes impliqués dans un processus particulier en recherchant tous les mutants affectés dans ce processus. C’est ainsi qu’un ensemble de gènes responsables de la synthèse de cellulose dans les cellules végétales a été caractérisé en analysant des mutants d’insertion d’Arabidopsis présentant un défaut de croissance. La cellulose est, en effet, un constituant de la paroi des cellules végétales. Elle est nécessaire à l’allongement des cellules qui forment les fibres. Les gènes mutés sont isolés en recherchant les séquences dans lesquelles est intégré l’ADN-T d’Agrobacterium tumefaciens. La démonstration que ces gènes sont bien impliqués dans la synthèse de la cellulose est faite en vérifiant que les plantes mutantes dans lesquelles on introduit une copie active du gène retrouvent une croissance normale.

• Inactivation spécifique de gènes
La transgénèse permet d’inactiver un gène de façon spécifique, en introduisant dans la plante une construction particulière qui va conduire à la dégradation spécifique de l’ARN messager du gène cible, et donc à l’absence de production de la protéine correspondante.
A l’INRA, cette stratégie a été employée avec succès pour déterminer le rôle d’une enzyme, la C-O-Méthyl transférase (COMT) dans la synthèse de la lignine. La lignine est un composé organique qui rigidifie la paroi de certaines cellules végétales, en particulier dans les vaisseaux conducteurs. La lignine des plantes à fleurs est constituée essentiellement de deux types de molécules : les unités G et les unités S. Des expériences biochimiques réalisées en tubes à essais suggéraient que la COMT était impliquée dans la synthèse des unités G et S. Des peupliers transgéniques contenant une construction inhibant l’expression de cette enzyme produisent des unités G mais pas d’unités S, démontrant que, contrairement à ce que suggéraient les résultats obtenus in vitro, la COMT intervient uniquement dans la production des unités S de lignine.

• Clonage positionnel de gènes d’intérêt agronomique
Un autre exemple d’utilisation des approches de génomique concerne l’isolement, chez le melon, d’un gène conférant aux plantes qui le portent une résistance marquée aux pucerons. L’intérêt d’un tel gène pour l’agriculture est ici évident, mais il est également intéressant d’un point de vue fondamental, puisqu’on ne connaît presque rien des mécanismes mis en jeu dans une telle résistance. Dans le cadre de Génoplante (voir p10), un programme de recherche visant à la caractérisation moléculaire du gène en cause a été entrepris. La première étape a consisté à réaliser une carte génétique du melon, à déterminer entre quels marqueurs se trouvait le gène recherché puis à affiner la carte dans cette zone. Par ailleurs une banque du génome du melon a été construite. Les chercheurs travaillent actuellement à identifier le fragment d’ADN de la banque portant le gène de résistance en utilisant les marqueurs les plus proches de ce gène et espèrent isoler ce dernier dans un proche avenir.

2.5.2. Régulation de l’expression des gènes

• Les fusions de promoteurs
L’expression de l’ensemble des gènes d’un organisme vivant est régulée de façon précise. Certains gènes sont exprimés dans les cellules d’un organe particulier ou pendant une période donnée ou encore sous l’action d’un stimulus spécifique. Ce sont des séquences de l’ADN appelées régulatrices, situées en général dans le promoteur d’un gène, qui déterminent le profil d’expression de celui-ci. L’étude de ces régions régulatrices est fondamentale lorsqu’on veut comprendre la fonction d’un gène. Un moyen simple pour cela consiste à construire un gène chimérique constitué du promoteur du gène dont on veut étudier la régulation et de la séquence codante d’un gène “rapporteur”, c’est-à-dire un gène codant une protéine facilement repérable dans les tissus de la plante. On transforme ensuite la plante avec ce gène chimérique et on peut directement observer le profil d’expression d’un tel gène rapporteur dans les tissus ou organes de la plante transgénique.
Certains outils de génomique permettent de systématiser ces études. Par exemple, certaines collections de mutagenèse insertionnelle ont été réalisées avec des constructions qui permettent de mettre en évidence ces éléments de régulation dans tout le génome. On parle alors de « piège à promoteurs » (voir encadré). De nombreux promoteurs, contrôlant l’expression de gènes dans divers organes ou différentes conditions, ont ainsi été découverts dans le génome d’Arabidopsis. Ces collections sont également utilisées pour identifier et isoler de façon systématique des promoteurs actifs dans tel ou tel organe ou en réponse à tel ou tel stimulus. Leur étude permettra non seulement de mieux comprendre les mécanismes de régulation des gènes mais fournira également des outils précieux pour mieux maîtriser l’activité de transgènes dans des plantes.

Pièges à promoteurs Photo P. Mollier © INRA Expression du gène GUS dans des grains de pollen d'Arabilopsis.

L’ADN-T utilisé pour créer la collection de transformants d’Arabidopsis au centre INRA de Versailles contient la séquence codant la protéine GUS (qui à partir d’un substrat incolore, catalyse la formation d’un produit bleu facilement observable), sans promoteur. Si cet ADN-T s’intègre dans le génome d’un transformant en aval d’un promoteur, l’expression du gène GUS sera induite et régulée de la même façon que le gène auquel ce promoteur appartient. On saura ainsi comment est régulé le gène gouverné par ce promoteur.

Photo : P. Hilson © INRA

Cette image illustre la comparaison entre ARN messagers présents dans les feuilles et dans les fleurs de l’arabette, grâce à une puce à ADN.

Chaque point correspond à un gène distinct. Les ARN messagers de feuille sont représentés en vert, ceux de fleur en rouge. Les points verts indiquent donc les gènes préférentiellement exprimés dans la feuille, les points rouges ceux exprimés dans la fleur. Les points jaunes indiquent les gènes exprimés également dans les deux organes, les points non colorés les gènes qui ne sont pas exprimés. L’expression comparée de plus de 100 gènes est mesurée sur cette image.

• Les puces à ADN
Une approche prometteuse de la génétique fonctionnelle consiste à identifier de façon exhaustive tous les gènes actifs dans un organe donné, ou en réponse à des conditions environnementales particulières (sécheresse, attaque de pathogène...). Pour cela, on fabrique une “puce à ADN” c’est-à-dire un support sur lequel sont fixés et ordonnés tous les gènes identifiés dans le génome de l’espèce. C’est d’ores et déjà réalisé pour des organismes comme la levure dont le génome est entièrement séquencé depuis plusieurs années, mais également pour Arabidopsis dont le séquençage du génome vient d’être terminé. Sur ce support, on applique ensuite un mélange des ARN messagers isolés à partir de l’organe étudié, ayant ou non subi le stress que l’on étudie. Ces ARN reconnaissent les séquences d’ADN auxquelles ils correspondent et s’hybrident avec elles. On peut par exemple soumettre un lot de plantes à un stress hydrique puis extraire les ARN messagers des racines de ces plantes. On aura extrait par ailleurs les ARN messagers des racines d’un lot de plantes arrosées normalement. Dans les ARN messagers obtenus pour chaque lot, seuls seront représentés les gènes qui sont actifs dans la racine dans les conditions données. Si on utilise ces ARN comme sonde sur une puce à ADN portant l’ensemble des gènes de la plante, on peut révéler en une seule expérience l’ensemble des gènes qui sont exprimés dans la racine. Si on compare les résultats obtenus avec les ARN extraits des plantes stressées et ceux obtenus avec les ARN des plantes cultivées en conditions normales, on peut identifier les gènes dont l’expression est induite par le stress, ceux où elle est inhibée et ceux pour lesquels elle est inchangée.