OGM et Alimentation

Au cours des dernières années, la fermentation alcoolique en souche pure sélectionnée a pris le pas sur la fermentation plus traditionnelle par des populations de levures indigènes, y compris pour des produits de haut de gamme. Il existe tout un éventail de souches disponibles offertes au choix de l'oenologue en vue de l'ensemencement. Dans ce contexte général, la transgénèse peut intervenir pour compléter les aptitudes des souches les plus performantes, aptitudes que les procédures de sélection ou de génétique classique sont impuissantes à obtenir ou à réunir dans une même souche.

Pierre Barre
Laboratoire de Microbiologie et Technologie des Fermentations, INRA Montpellier

Les limites de la transgénèse pour la levure oenologique sont d'ordre réglementaire, d'acceptabilité par le consommateur et de risque, ainsi, bien sûr que d'ordre technologique et scientifique.

* Les limites d'ordre réglementaire sont celles portant sur les OGM en général. Toutefois, nombre de constructions potentielles portent sur l'expression de séquences codantes homologues : suivant la précision de la construction (par exemple, absence de toute séquence codante hétérologue, comme certains gènes utilisés comme marqueurs), ces souches pourront être considérées comme obtenues par autoclonage et donc, ne pas être soumises à la réglementation sur les OGM. Il se dégage là un domaine d'étude prioritaire, qui est celui de la précision et de la finesse de l'intervention.

* L'acceptabilité par le consommateur et la notion de risque : la filière oenologique a conservé à juste titre une bonne partie de son aspect traditionnel et conduit à des produits de caractère festif. Dans ces conditions, les exigences des consommateurs seront encore plus fortes que dans d'autres types de production.

L'absence dans la boisson finale de toute séquence d'ADN hétérologue ou de ses produits d'expression éliminent à priori les craintes que suscite la rémanence de ces molécules dans l'aliment. Cet aspect a contribué à la non prise en compte, dans les programmes actuels de l'INRA, de la construction de souches excrétant dans le milieu des protéines hétérologues, comme par exemple des enzymes exocellulaires.

Le risque de dissémination non volontaire des séquences introduites ou du micro-organisme modifié est pris en compte de la façon suivante :

- nous n'utilisons pour l'instant comme gène hétérologue transformant, que des séquences d'ADN prélevées dans des micro-organismes dont la présence est constante en milieu vin (par exemple bactéries lactiques) ;

- la levure construite devra être incapable de sporuler et donc d'entreprendre des fusions cellulaires au sein de son habitat ;

- l'éventuel transfert non sexué des séquences hétérologues sera étudié en milieu fermé ;

- la souche modifiée ne devra pas posséder d'avantage concurrentiel au sein d'une population indigène ;

- enfin un outil de traçabilité de chaque souche modifiée devra être mis au point.

 * Les limites scientifiques et technologiques : l'intervention par transgénèse ne peut raisonnablement se concevoir que dans un contexte où le déterminisme biochimique, physiologique et génétique de la propriété technologique à transférer ou à modifier est suffisamment connu. De plus toute modification reposant sur une expression multigénique complexe ne saurait être abordée. Peu de propriétés oenologiques répondent pour l'instant à l'ensemble de ces critères. Par contre la recherche dispose d'outils puissants applicables à la levure, même si certaines approches, comme l'intégration multicopie, sont encore insuffisamment maîtrisées dans les souches industrielles. Ces dernières possèdent de plus un génome présentant des différences importantes avec celui des souches de laboratoire.

Exemples d'études en cours

* Le contrôle de l'acidité constitue un problème technologique majeur, que ce soit dans le sens d'une diminution, ou pour corriger un niveau trop faible (cas très fréquent dans les régions chaudes).

- Souches de levure réalisant la fermentation malolactique : la FML -dégradation de l'acide malique des moûts en acide lactique par des populations de bactéries lactiques- reste encore une étape difficilement maîtrisée, malgré les progrès récents et significatifs apportés à la technologie des ensemencements bactériens; de plus, dans certains cas, les consé-quences secondaires du dévelop-pement de telles populations sont à éviter. Sa réalisation par une levure pallierait ces inconvénients. Une telle souche de laboratoire a été obtenue par l'expression de deux gènes hétérologues : le gène de structure de l'enzyme malolactique prélevé dans une bactérie lactique et le gène de structure d'un transporteur permettant le passage de l'acide malique du milieu vers l'intérieur de la cellule, prélevé dans un autre genre de levure. Cette souche modèle réalise une fml complète. Reste à construire une souche industrielle susceptible d'être utilisée. Compte tenu des contraintes, cette étape risque de durer un à deux ans.

- Souches de levure productrices d'acide L+ lactique : il s'agit d'un acide naturellement présent dans de nombreux aliments comme les yaourts, mais également les vins, en conséquence de la fermentation malolactique. Le principe de la manipulation consiste à introduire un gène de bactérie lactique dont le produit d'expression, la L+ lacticodéshydrogénase, intervient en fin de voie métabolique des sucres. On obtient ainsi des levures exprimant une fermentation mixte alcoolique-lactique. Il est possible, au moyen du type de construction réalisée, de moduler la proportion d'acide lactique formé (aux environs de quelques pour cent pour les besoins de l'oenologie). La modification de l'acidité des vins obtenus au laboratoire est significative et cohérente (tableau 1). Là encore, la souche industrielle reste à construire, avant d'en évaluer toutes les aptitudes technologiques.

* Souches de levure à rendement élevé en glycérol

Il s'agit là d'abaisser le rendement en éthanol de la fermentation alcoolique et donc la teneur en alcool des produits, en augmentant la production d'autres composés naturels de la fermentation alcoolique comme le glycérol, en concentration compatible avec la qualité des produits. En amplifiant le gène sauvage de la glycérol-3-phosphate déshydrogénase, il est possible d'obtenir une hyperproduction significative de glycérol (de l'ordre de 3 à 4 fois par rapport au témoin), mais accompagné d'un ensemble d'autres sous produits dont certains ne sont pas favorables à la qualité. C'est ce dernier aspect qui est à l'heure actuelle à l'étude, dans le cadre d'une participation au programme européen «Biotechnology, Cell Factory». Il est à noter que cette étude peut conduire à des souches obtenues par autoclonage.

* Prévention de la formation de carbamate d'éthyle

Le carbamate d'éthyle présent à l'état de trace dans tous les produits fermentés (surtout ceux ayant subi un traitement thermique), présente des propriétés cancérigènes. Les concentrations habituellement rencontrées dans les vins ne posent pas de problèmes de santé publique, même en cas de consommation régulière. Toutefois il s'agit là d'un problème identifié, qui mérite donc d'être suivi, d'autant plus que les consommateurs américains et canadiens y portent une attention toute particulière pouvant se traduire à terme par une réduction drastique des normes admises. Le carbamate d'éthyle est formé lors d'une réaction chimique très lente entre l'éthanol et un certain nombre de précurseurs dont le plus constant est l'urée. Ce dernier composé est lui-même libéré en faible quantité dans le milieu, suite au métabolisme azoté de la levure. Des chercheurs japonais ont réussi à restreindre cette libération par interruption du gène de l'arginase de la levure : cette manipulation a pour conséquence une baisse très significative de la teneur en carbamate d'éthyle du saké correspondant. Un tel programme pourrait être conçu dans le cadre oenologique.

Conclusions et perspectives

Les outils nécessaires à la transgénèse des souches de levure oenologique sont fonctionnels. La disponibilité de la séquence complète du génome de Saccharomyces cerevisiae constitue en outre un atout considérable. Quelques améliorations méthodologiques restent toutefois à apporter dans le domaine de l'intégration multicopie dans les souches industrielles, ainsi que dans la précision de l'excision des séquences non indispensables à l'expression recherchée, comme les gènes marqueurs. L'apport de la transgénèse concerne plusieurs grands domaines d'intérêt :

- apporter des outils technologiques originaux permettant, par exemple, de faire réaliser une FML sans subir les conséquences organoleptiques du développement d'une population de bactéries lactiques, lorsque elles sont jugées néfastes ;

- contribuer à l'amélioration des qualités hygiéniques des produits en permettant, entre autres, la diminution des additifs chimiques (produits acidifiants ou de stabilisation microbiologique), l'abaissement modéré de la teneur en alcool, ou des garanties supplémentaires dans le domaine du carbamate d'éthyle ;

- constituer des outils irremplaçables d'études technologiques comme, par exemple, permettre d'évaluer de façon très spécifique l'influence de la floculation sur les aptitudes technologiques d'une souche, ou bien les conséquences secondaires d'une FML bactérienne ;

- fournir des outils très puissants d'étude de mécanismes physiologiques comme le transport des sucres à l'intérieur de la cellule, ou bien les phénomènes de stress spécifiques de nos conditions de milieu, mécanismes intervenant fortement sur la fiabilité des fermentations et qui étaient, jusqu'à présent, très peu étudiés. Ce dernier domaine, extrêmement porteur, justifierait à lui seul les études menées.

L'extension de la construction de souches manipulées dépendra très fortement des progrès qui seront accomplis dans la description du contexte scientifique général entourant les propriétés technologiques considérées. Ce fait interviendra fortement dans les délais nous séparant des constructions correspondantes. Ces délais, qui pour certains modèles déjà décrits peuvent être évalués à deux ans, dépendront également beaucoup du degré d'exigence dans la précision des constructions et dans le niveau de garantie que se fixeront en matière de risques divers, scientifiques, législateurs et consommateurs.

[R] Pour en savoir plus

Volschenk H., Viljoen M., Grobler J., Bauer F., Lonvaud-Funel A., Denayrolles M., Subden RE., Van Vuuren HJJ, 1997. Malolactic fermentation in grape must by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae. Am. J. Vitic. Enol., 48, 193-197.

Bony M., Bidart F., Camarasa C., Dulau L., Barre P., Dequin S., 1997. Metabolic analysis of Saccharomyces cerevisiae engineered for malolactic fermentation. FEBS Letters, 410, 452-456.

Ansanay V., Dequin S., Blondin B., Barre P., 1993. Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis. FEBS Letters, 332, 74-80.

Dequin S., Barre P., 1994. Mixed acid-alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae expressing the Lactobacillus casei L(+)-LDH. Bio/Technology, 12, 173-177.

Michnick S., Dequin S., Roustan J.L., Remize F, Barre P., 1997. Modulation of glycerol and ethanol yields during alcoholic fermentation in Saccharomyces cerevisiae strains overexpressed or disrupted for GPD1 encoding glycerol 3P déshydrogénase. Yeast, 13, 783-793.