Quelques repères scientifiques

L'universalité du vivant
les micro-organismes et la transgénèse
la transgénèse, outil pour l'étude fine de la biologie de la reproduction des plantes à fleurs
la caractérisation du génome de l'arabette à l'INRA
les dernières évolutions des techniques de transfert de gènes chez les bactéries
transgénèse animale : les recombinaisons homologues

Michel Caboche, Yves Chupeau, Christian Dumas, Stanislav-Dusko Ehrlich, Alexandra Gruss, Louis-Marie Houdebine, Emmanuelle Maguin.

[R] L'universalité du vivant

La notion fondamentale qui sous-tend le développement des travaux de génie génétique est bien l'unité du monde vivant. C'est l'universalité du support de l'information génétique, de l'organisation linéaire du génome et du code génétique qui a permis la transgénèse.

Tous les organismes vivants sans exception fabriquent leurs constituants de base de la même manière. Ainsi, de nombreuses enzymes, les molécules-outils du métabolisme et de la construction des organismes vivants, isolées d'organismes aussi différents que bactéries, mammifères et plantes, ont des fonctions similaires dans ces organismes et une structure très voisine. Cette grande similitude se retrouve au niveau des gènes qui les codent.

Exprimer dans une plante une enzyme du métabolisme des acides aminés en utilisant pour ce faire un gène de levure ou de bactérie n'est pas une performance aussi extraordinaire qu'il y paraît à première vue et pourrait se comparer au remplacement d'une batterie par une autre sur un véhicule. Ce n'est pas parce que ces substitutions de gènes entre bactéries et plantes ne se produisent que très rarement dans la nature qu'elles deviennent pour autant «contre nature». Au contraire, ces phénomènes d'échange ont joué un rôle important dans l'évolution des bactéries, et par conséquent des organismes supérieurs puisqu'ils sont issus de l'association de plusieurs génomes notamment bactériens.

Les découvertes les plus récentes de la génétique moléculaire renforcent encore la notion d'universalité de l'information génétique. Certains gènes, certaines séquences de l'ADN de ces gènes, sont strictement identiques pour les bactéries, les plantes et les animaux, y compris l'homme. Ces séquences codent des molécules dont les conformations et donc les fonctions sont, semble-t-il, tellement essentielles à la vie qu'elles sont nécessairement identiques dans tous les règnes vivants.

À ce niveau d'analyse moléculaire, la distinction entre espèces s'estompe. Une plante dispose d'un répertoire de quelques dizaines de milliers de gènes dont l'ensemble organisé constitue l'identité génétique. L'introduction d'un ou plusieurs gènes dans cette plante, qu'ils soient d'origine bactérienne ou animale ne change pas suffisamment ce patrimoine génétique pour remettre en question son identité. Par exemple, l'introduction d'un gène de porc dans une plante ne donnerait pas à cette plante un caractère de «chimère» plante-animal comme des raccourcis le suggèrent parfois... Il se peut même que ce gène isolé d'un porc existe déjà chez la plante receveuse, même s'il n'a pas les mêmes séquences de régulation. Dès lors, un gène présent à la fois chez une plante et chez le porc est-il un gène de plante ou de porc ? Il s'agit d'un gène tout simplement, qui ne peut être attribué particulièrement à aucune espèce, tout comme de nombreux autres. Les gènes ne trouvent leur appartenance à une espèce que par leur environnement génétique, par le groupe de gènes permettant la constitution d'un individu auquel ils appartiennent. Il est cependant difficile de généraliser ce raisonnement. Qu'en sera-t-il quand on sera capable de transférer plusieurs dizaines ou plusieurs centaines de gènes ? Où sera la limite ?

L'analyse et la cartographie des génomes végétaux donnent une vision très dynamique de leur évolution. Ainsi pour la famille des poacées, l'une des dernières apparues sur la terre (et l'une des plus étudiées car elle comporte pratiquement toutes les céréales), tous les génomes résultent de la réorganisation, de l'amplification (duplication en plusieurs exemplaires du ou des mêmes gènes) du génome d'un riz ancestral. Avec les mêmes gènes, et les mêmes arrangements de blocs importants de gènes sur des portions de chromosomes, des hybridations interspécifiques suivies de réarrangements de portions de génome ont littéralement fait jaillir des espèces telles que les riz, les blés, les maïs, les cannes à sucre...

Alors que tous les organismes fonctionnent avec un grand nombre de gènes identiques ou similaires, l'évolution, qui repose justement sur la malléabilité de l'ADN, a conduit aussi bien à des pertes de fonctions qu'à des gains, à la suite d'amplification de portions d'ADN puis de mutations. Mais ce qui distingue fondamentalement les règnes (1) puis les familles (2) et les espèces (3) résulte davantage de différences dans les séquences de régulation de l'activité des gènes, ainsi que dans l'organisation des gènes le long des chromosomes. Pour faire exprimer un gène de bactérie dans une plante, s'il n'est pas impératif d'en modifier la séquence codante, il est, par contre, indispensable de remplacer les séquences de régulation de type bactérien par des séquences de régulation de plante.

Enfin les découvertes récentes sur le fonctionnement du génome (la réplication de l'ADN, les mécanismes de réparation, de traduction...) viennent compléter la notion d'universalité déjà claire pour la seule structure du génome. Elles montrent en particulier que les mécanismes de l'intégration des transgènes reposent sur les processus naturels de recombinaison et de réparation de l'ADN qui interviennent également lors de la reproduction sexuée. [R]

[R] Les micro-organismes et la transgénèse

Pour connaître les potentialités des micro-organismes, comme celles de tout organisme vivant, dans le but de les modifier afin de mieux les utiliser ou mieux les combattre, il est très utile de disposer d'un catalogue de leurs gènes, de la «séquence» de tout leur génome. Actuellement douze micro-organismes sont déjà entièrement séquencés et une vingtaine sont en cours de séquençage par la communauté scientifique. Cela permet soit de développer des modèles, utiles pour la compréhension du fonctionnement des êtres vivants dans leur ensemble (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae...), soit de développer des recherches finalisées notamment dans le domaine médical ou agro-alimentaire. Certains micro-organismes, très utilisés dans les processus agro-alimentaires, comme Lactoccocus lactis, sont en cours de séquençage à l'INRA.

Mais quand le catalogue des gènes est obtenu, on est loin d'avoir tout compris. Pour environ la moitié des gènes, il n'est pas possible de deviner leur rôle, la fonction biologique de leur produit, ce qui est pourtant essentiel. Le microbiologiste cherche d'une part à comprendre comment «fonctionnent» les micro-organismes, et d'autre part à les améliorer pour qu'ils soient plus utiles à l'homme. La transgénèse l'aide dans les deux cas. Cet outil permet par exemple d'inactiver le gène qui code pour une protéine dont on ignore la fonction. L'observation du fonctionnement du micro-organisme modifié donne des informations très précieuses sur le rôle de la protéine étudiée. La transgénèse permet aussi d'«amplifier» un gène, d'en introduire plusieurs copies dans le même génome, pour accentuer son expression. La mesure du produit ou des effets de cette expression donne aussi des renseignements précieux.

On peut également ajouter des gènes d'un micro-organisme à un autre pour modifier les propriétés de ce dernier. On a, par exemple, pu transférer à des souches de Lactoccocus lactis d'intérêt industriel des gènes d'autres souches de la même espèce plus résistantes aux virus bactériophages qui peuvent perturber les fabrications de fromage. Des souches d'intérêt industriel plus résistantes ont ainsi été obtenues à l'INRA. Des tests d'utilisation sont en cours avec l'industrie.

Les techniques du génie génétique sont actuellement indispensables en microbiologie. Elles seules permettent des modifications assez précises et contrôlées pour isoler les phénomènes et les attribuer à tel ou tel gène de façon rigoureuse. Pour modifier les micro-organismes, cette méthode est considérablement plus sûre que les autres. La précision est devenue telle qu'il est possible de modifier une seule paire de bases (4) sur les 2,5 millions qui constituent le génome de Lactoccocus lactis et d'agir ainsi directement avec une précision parfaite sur le chromosome. Le concept général de ce type de transferts dérive de travaux menés à l'INRA.

Les recherches menées à l'INRA permettent ainsi de mieux comprendre l'expression du génome et sa régulation. Un exemple de l'application de ces travaux porte sur la capacité des bactéries à résister aux stress. Une molécule, l'«AMP cyclique», connue précédemment comme une «alarmone» (5), semble rendre les lactocoques particulièrement sensibles aux divers stress. Plusieurs mutants, chez lesquels sa synthèse est affectée, résistent bien mieux et survivent dans des conditions mortelles pour les souches sauvages. Une meilleure survie dans les conditions industrielles pourrait permettre de développer des levains de meilleure qualité. Certains avancent l'hypothèse qu'une meilleure compréhension du fonctionnement fondamental des micro-organismes, des mécanismes qui le régissent, pourrait même être très utile pour la compréhension du fonctionnement des organismes supérieurs.

Autre objectif des travaux : identifier de nouvelles applications comme le développement d'antibiotiques jusque là inconnus. L'identification de nouveaux gènes essentiels pour la survie bactérienne donnerait en effet des cibles pour atteindre ce but. Le travail est effectué chez Bacillus subtilis.

Il est aussi possible de réunir les fonctions de deux micro-organismes dans un seul : la fermentation alcoolique et la fermentation malo-lactique du vin par exemple, d'où une plus grande qualité avec moins de complexité pour le vinificateur. Des travaux sont menés aussi pour renforcer l'action de micro-organismes utiles pour la dépollution ou pour leur conférer de nouvelles fonctions. L'amélioration des fermentations du lait, de la viande, des fruits, du pain est étudiée. Ainsi des souches de lactocoques, dont la capacité aromatisante par synthèse de diacétyle (le goût du beurre) a été accrue de dix fois, ont été développées. Elles sont actuellement testées par des partenaires industriels.

Enfin, le séquençage des facteurs de virulence des micro-organismes pathogènes des animaux devrait permettre de mieux cibler les traitements. Par exemple, la connaissance complète du génome de la souche K12, non pathogène, permet certes de connaître l'organisation générale du génome de l'espèce Escherichia coli mais doit être complétée par une analyse plus fine, allant jusqu'au séquençage des régions codant pour la virulence des souches pathogènes, dont K12 est dépourvue.

La mutation des gènes ainsi identifiés et leur transfert dans des souches de référence permet ensuite d'affiner la connaissance des mécanismes précis du pouvoir pathogène et de l'immunogénicité. Ainsi peut-on progresser dans la connaissance des mécanismes de virulence, proposer de nouvelles méthodes de vaccination, affiner les outils de diagnostic. De même, la caractérisation, l'inactivation et le transfert de gènes responsables de résistances aux antibiotiques, permettent-ils de comprendre les bases moléculaires de cette résistance et de mieux orienter la thérapeutique. Les équipes de pathologie de l'INRA développent ces approches non seulement sur E. coli mais sur d'autres bactéries pathogènes (Brucella, Chlamydia, Salmonella, Staphylocoques par exemple), et sur certains parasites. [R]

(4) Le plus petit élément constitutif de l'ADN, molécule support de l'hérédité dans les chromosomes.[vu]
(5) Hormone d'alarme [vu]

[R] La transgénèse, outil pour l'étude fine de la biologie de la reproduction des plantes à fleurs

Chez de nombreux végétaux («angiospermes»), la fleur est le siège de la reproduction sexuée qui conduit à la formation de la graine contenue dans le fruit. Le bon déroulement de ces processus conditionne la survie et la dissémination de l'espèce. La compréhension fine des phénomènes mis en oeuvre peut permettre d'agir sur le mode de reproduction. L'homme a déjà orienté, sans l'aide de la transgénèse, certaines espèces vers une pollinisation croisée, pour obtenir des hybrides, alors que ce n'était pas leur mode naturel de reproduction. C'est le cas pour le maïs, le tournesol, dans une certaine mesure et plus récemment pour le colza, le blé... Une connaissance très précise des génomes grâce à la biologie moléculaire, et les possibilités nouvelles de transfert de certains gènes impliqués dans la biologie de la reproduction, permettent d'envisager d'aller plus loin.

La stérilité mâle (6), par exemple, peut être obtenue à l'aide de la transgénèse beaucoup plus efficacement que par les méthodes utilisées jusqu'ici. Elle permet en effet de bloquer très précisément certains gènes intervenant dans la production du pollen. La compréhension fondamentale de phénomènes en cause dans la biologie de la reproduction, grâce à l'utilisation de la transgénèse comme outil permettant d'«éteindre» ou «allumer» certains gènes, pourrait entraîner des évolutions considérables du mode de production des semences et même de la gestion des productions végétales par les agriculteurs. Par exemple, il sera sans doute rapidement possible d'intervenir sur le contrôle, à l'échelle moléculaire, de la capacité d'autofécondation des plantes. Le contrôle de la compatibilité pollen-stimate (7) et ses conséquences sur les modes de reproduction végétale sont activement étudiés.

Des recherches autour de quatre thèmes touchant à ces phénomènes sont mises en oeuvre au Laboratoire de reproduction et développement des plantes de Lyon (CNRS, ENS, INRA) en utilisant de manière intégrée des approches complémentaires de génétique, de biologie cellulaire et moléculaire (dont la transgénèse), de biochimie ou de physiologie :

- le déterminisme du sexe et la formation des organes reproducteurs ;
- le contrôle de la pollinisation et l'analyse des phénomènes d'auto-incompatibilité sexuelle ;
- les mécanismes contrôlant la double fécondation des angiospermes ;
- l'analyse du programme de développement précoce de l'embryon et l'albumen (8).

(6) Absence d'émission de pollen fertile, indispensable à la production d'hybrides chez certaines espèces comme le tournesol, le colza, le blé... Leur reproduction naturelle est en effet fortement liée à une autofécondation spontanée et les deux sexes se trouvent dans la même fleur, ce qui rend la castration très difficile.[vu]

(7) Le stigmate est la partie réceptrice du pistil.[vu]

(8) Réserve nourricière du grain.[vu]

 [R] La caractérisation du génome de l'arabette à l'INRA

Les unités d'Amélioration des plantes et de Biologie cellulaire du centre INRA de Versailles participent activement au vaste programme international de recherches en génétique utilisant la plante Arabidopsis thaliana (arabette), une petite espèce de crucifère sauvage parente du colza. Le centre de Versailles développe les aspects essentiels des programmes de caractérisation du génome de l'arabette. Le noyau dur de ces programmes consiste à générer des mutations par insertion de transgènes qui servent «d'étiquettes». Lorsque la mutation porte sur un caractère qui intéresse telle ou telle équipe, l'étiquette facilite considérablement le repérage du gène muté dans l'ensemble du génome, puis son clonage et l'étude de son rôle. Aujourd'hui 35 000 mutants de ce type sont déjà disponibles et l'objectif est d'atteindre 50 000, de façon à muter et étiqueter l'ensemble des gènes de l'arabette. Ce très lourd travail de création de matériel expérimental stratégique est à la charge de la station d'Amélioration des Plantes. Elle doit non seulement créer ces mutants, mais encore assurer la récolte des descendances de chaque plante, sur au moins deux générations, et entretenir cette collection c'est-à-dire la régénérer tous les trois ou quatre ans...

Cette collection de mutants conduit à la détermination de l'ensemble des gènes d'une espèce, et donc, en raison de la très grande similitude des génomes, à caractériser la majeure partie du génome des plantes. Ces extensions aux autres plantes, hypothétiques il y a encore quelques années, se vérifient au fur et à mesure de la caractérisation. Ainsi, des gènes d'Arabidopsis se retrouvent tout à fait semblables chez le maïs, le blé... et avec des fonctions identiques.

Dans le réseau mondial de laboratoires qui participent au décryptage du génome de l'arabette, l'INRA s'est également plus lourdement investi dans l'effort de cartographie d'un chromosome. Enfin, des dispositifs complémentaires assez puissants (collection des gènes exprimés, et analyse de leur expression, approche de génétique inverse...) permettent à l'INRA de disposer d'un ensemble cohérent de moyens d'analyse, et de jouer un rôle particulièrement actif dans le réseau mondial. [R]

[R] Les dernières évolutions des techniques de transfert de gènes chez les bactéries

Le génome des bactéries se modifie naturellement sous l'action conjuguée de deux facteurs : l'action des enzymes impliquées dans le métabolisme de l'ADN et les conditions environnementales, qui sélectionnent les individus présentant la combinaison la plus performante pour un contexte donné. Il est tentant d'utiliser cette capacité qu'ont les bactéries à modifier leur génome pour mieux les adapter aux procédés industriels ou encore créer des produits nouveaux.

Emmanuelle Maguin
Laboratoire de Génétique Microbienne

Alexandra Gruss
Laboratoire de Recherches Laitières et de Génétique Appliquée, INRA Jouy-en-Josas

Les bactéries lactiques sont utilisées en agro-alimentaire pour de nombreuses productions : fromages, yaourts, charcuteries, salaisons...Le choix des souches s'effectue en fonction du type de production suivant différents critères plus ou moins bien définis. Pour les souches utilisées en fermentation laitière, on trouve les propriétés d'acidification, de protéolyse, de résistance aux bactériophages (virus bactériens) et la reproductibilité de la croissance. Une souche ne possède pas, à elle seule, toutes les propriétés requises et un mélange de souches, ou ferment mixte, est généralement nécessaire. Cependant, un ferment, même soigneusement sélectionné, peut perdre ses qualités. Le matériel génétique d'une souche peut, naturellement, être remanié ou en partie perdu. De plus, la composition d'un ferment mixte peut changer si les conditions de conservation sont plus favorables à la survie de certaines souches. L'approche génétique peut offrir une alternative aux méthodes traditionnelles pour mieux comprendre le rôle des bactéries dans la fermentation et répondre à certains des problèmes rencontrés en production. Depuis une quinzaine d'années, le laboratoire de génétique microbienne s'est plus particulièrement intéressé à la bactérie lactique Lactococcus lactis (L. lactis) et à son génome.

Petits génomes et grande plasticité

Le chromosome d'une bactérie contient plusieurs milliers de gènes (environ 2500 pour L. lactis), chacun codant pour une protéine différente. Mais la plupart des bactéries portent aussi des gènes sur d'autres éléments appelés plasmides. D'une manière générale, le chromosome porte les gènes indispensables à la survie de la bactérie, et les plasmides portent des gènes nécessaires seulement dans certaines conditions.

Au sein d'une espèce, des gènes chromosomiques diffèrent d'une souche à l'autre. Comment expliquer ces variations ? Les bactéries vivent dans des communautés qui peuvent atteindre 1011 bactéries par millilitre (fromage, tube digestif) ; les possibilités d'échange d'ADN sont, de ce fait, nombreuses. Certaines bactéries contiennent des gènes chromosomiques leur permettant, à faible fréquence, de transférer leur chromosome (ou une partie du chromosome) à une autre bactérie de la même espèce. Toutes les bactéries portent des gènes qui réalisent certains remaniements génétiques. Une bactérie remaniée possède parfois, du fait de cette modification, un avantage sur les autres individus. Dans ce cas, cette bactérie et ses descendants deviendront majoritaires dans la population. Par exemple, l'infection par un bactériophage est souvent mortelle pour une bactérie. Lorsqu'un remaniement la rend résistante au bactériophage, elle survit et se multiplie contrairement à ses voisines non remaniées.

Il est tentant d'utiliser cette capacité qu'ont les bactéries à modifier leur génome pour mieux les adapter aux procédés industriels : pourquoi ne pas les modifier pour qu'elles fermentent plus rapidement le lait, qu'elles confèrent un nouveau goût au fromage, ou encore qu'elles survivent mieux dans le tractus intestinal si elles ont, comme certains l'affirment, un effet bénéfique sur la santé ?

Pourquoi des bactéries génétiquement modifiées ?

Jusqu'à présent, on recherchait les souches présentant des caractères intéressants dans des collections de bactéries lactiques provenant d'isolats naturels. Cependant, les souches "naturelles" sélectionnées pour un caractère donné ne sont pas forcément bien adaptées aux procédés industriels et présentent parfois d'autres caractères défavorables, tels que la sensibilité aux bactériophages, une croissance lente, la production de composés aromatiques indésirables ou une mauvaise conservation. Aujourd'hui, il est possible de modifier de manière ciblée le génome (donc les caractères) de bactéries déjà utilisées comme ferments lactiques en production.

Des souches ayant des propriétés modifiées ont été construites à l'INRA : modification d'enzymes pour changer le goût (protéases, peptidases ou enzymes du métabolisme), ou la texture (glycosylases) d'un produit laitier. Il est aussi possible de réduire le temps d'affinage d'un produit en faisant surproduire à une bactérie certaines enzymes. L'équipe a aussi obtenu des souches résistant mieux au stress acide ou aux changements de température, ou à un ensemble de stress (température, acidité, carence nutritionnelle). De telles souches pourraient mieux survivre aux stress technologiques et s'avérer plus performantes en production. Par exemple, des bactéries résistant aux changements brusques de température survivront probablement mieux au procédé de conservation des ferments. En conséquence, la croissance des ferments après ensemencement dans le lait sera plus rapide et plus reproductible ; les pertes importantes qui découlent de mauvaises croissances seront évitées. Le consommateur pourrait trouver deux avantages à l'emploi de techniques génétiques : des produits nouveaux, des produits moins chers.

Les contacts avec des industriels de l'agro-alimentaire montrent leur intérêt pour l'utilisation de souches génétiquement modifiées mais aussi leur crainte à propos des réactions des consommateurs. Par nos achats, nous marquons notre satisfaction ou notre désapprobation concernant les produits du marché. Il est du devoir des scientifiques d'informer objectivement le consommateur pour qu'il puisse choisir, en connaissance de cause, les produits qu'il désire dans son assiette.

Des techniques de microchirurgie

Les techniques développées dans l'équipe permettent de modifier très précisément le génome et sont faciles à mettre en oeuvre. Il s'agit de :

- l'intégration en un point précis du génome d'une modification. Cette modification module l'activité d'un gène déjà présent dans la souche ou introduit un gène qui n'existait pas dans cette souche. C'est la technique de modification par recombinaison ;

- l'intégration au hasard dans le chromosome d'une séquence d'ADN, appelée séquence mobile, c'est la technique de modification par transposition.

* Utilisation d'un plasmide original

Les deux techniques développées au laboratoire reposent sur l'utilisation d'un plasmide à réplication thermosensible qui porte un gène de sélection permettant de repérer sa présence dans une bactérie par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou un gène d'utilisation du lactose dont l'activité est facile à mettre en évidence par coloration. Dans L. lactis, le plasmide se multiplie à +30° C et cesse de se multiplier à +37° C. De ce fait, lorsque les bactéries sont incubées à 37° C, le plasmide est perdu au fur et à mesure des générations, et les bactéries deviennent sensibles à l'antibiotique. Cette caractéristique permet d'introduire dans la souche le plasmide et l'ADN porteur de la modification, puis d'éliminer le plasmide après intégration de la modification dans le chromosome.

* Modification d'un gène par recombinaison

Nature des modifications
Avec cette technique, il est possible de réaliser des modifications du génome minimes (un nucléotide) ou, au contraire, très importantes (par exemple, élimination de plusieurs milliers de nucléotides). On peut par exemple :
- supprimer, diminuer ou augmenter l'activité d'un ou de plusieurs gènes ;
- modifier une activité enzymatique pour qu'elle agisse, par exemple, dans des conditions inhabituelles de pH ou de température ;
- intégrer un gène nouveau.

Comment obtenir la souche modifiée ?
Pour modifier une souche par cette technique, il faut :

- Le plasmide qui contient un gène de sélection permettant de repérer sa présence, par exemple un gène de résistance à un antibiotique ou un gène d'utilisation du lactose dont l'activité est facile à mettre en évidence par coloration ;
- La modification à introduire dans la souche qui peut être une mutation, un gène étranger,...
- Un fragment d'ADN  provenant de la souche à modifier. Ce fragment est donc parfaitement identique à une région du chromosome où l'on veut introduire la modification ; on dit qu'il est homologue à une partie du chromosome.

On positionne la modification au milieu du fragment homologue, puis on associe le plasmide, le fragment homologue et sa modification. L'ensemble est introduit dans la bactérie à modifier.

Des enzymes bactériennes (enzymes de recombinaison) permettent l'échange entre les régions identiques du plasmide et du chromosome, c'est la recombinaison homologue.
Cet échange conduit à l'intégration dans le chromosome du plasmide et de la région homologue modifiée. Puisque le plasmide apporte la résistance à un antibiotique, nous pouvons sélectionner les bactéries dans lesquelles l'échange a eu lieu.
Un second échange (toujours par recombinaison homologue), favorisé par la thermosensibilité du plasmide, permet d'éliminer de la bactérie les éléments non désirés, c'est-à-dire le plasmide dont le gène de sélection (résistance à un antibiotique ou autre...) et la région homologue non modifiée du chromosome.
Après ces deux échanges, la bactérie ne contient plus que la modification qui est située en un point précis et déterminé du chromosome.

Avantages et limites de cette technique

Cette technique permet de réaliser des modifications très diverses, parfaitement connues et précisément localisées, offrant ainsi la possibilité de moduler l'activité d'un gène. La souche modifiée ne contient pas d'ADN étranger sauf si la modification consiste en un gène originaire d'une autre espèce. Rappelons notamment qu'au final, le plasmide, dont le gène de sélection (résistance à un antibiotique ou autre...), n'est pas présent dans la souche modifiée. Cependant, il est nécessaire d'avoir une certaine connaissance du génome et surtout du gène à modifier. Il faut pouvoir déterminer la modification qui générera le caractère d'intérêt recherché.

* Modification d'une souche par transposition

Nature des modifications
On trouve dans les chromosomes bactériens de nombreuses séquences mobiles qui ont la particularité de s'intégrer n'importe où dans le génome de la bactérie. Cette propriété des séquences mobiles est utilisée pour inactiver au hasard des gènes. Parmi tous les mutants obtenus, nous sélectionnons ceux qui présentent un nouveau caractère d'intérêt.

Comment obtenir la souche modifiée ?
La séquence mobile est insérée dans le plasmide, puis l'ensemble est introduit dans les bactéries. En s'intégrant au hasard dans le chromosome, la séquence mobile réalise la modification : c'est l'étape de transposition. Elle entraîne avec elle le plasmide qui porte un gène de sélection, par exemple un gène de résistance à un antibiotique. Nous récupérons, en présence d'antibiotique, toutes les bactéries qui contiennent désormais dans leur chromosome la résistance à l'antibiotique associée au plasmide et à la séquence mobile.

Parmi ces mutants, nous isolons ceux qui présentent des caractères intéressants : résistance aux bactériophages, résistance aux stress ou production accrue d'arômes.

En utilisant la thermosensibilité du plasmide (c'est à dire en multipliant les bactéries d'intérêt à 30° C puis à 37° C), on élimine le plasmide et donc le gène de résistance à l'antibiotique de la bactérie choisie. Dans la souche modifiée il reste uniquement la séquence mobile intégrée dans un gène chromosomique que l'on peut identifier. La séquence mobile provenant d'une souche de l'espèce, il n'y a pas d'ADN  étranger dans la souche modifiée.

Avantages et limites de cette technique

Il n'est pas nécessaire de connaître le génome d'une souche pour la modifier. En effet, on n'a pas à définir au départ le gène à inactiver pour obtenir le caractère d'intérêt. Au contraire, les gènes sont inactivés au hasard et on peut déterminer quelle mutation a donné le caractère d'intérêt. On travaille donc sans a priori et en identifiant la mutation, on acquiert des connaissances sur la fonction des gènes.

La souche est modifiée par l'insertion de la séquence mobile, comme cela arrive dans la nature. Notre seule intervention est d'introduire transitoirement dans la souche le plasmide. Au final, la souche modifiée ne contient pas d'ADN étranger à l'espèce. Cependant, c'est l'intégration au hasard de la séquence mobile qui crée la modification. Il s'agira donc presque toujours de l'inactivation d'un gène. De plus, il peut arriver qu'au cours du temps, une copie de la séquence mobile s'insère aussi ailleurs dans le chromosome créant une seconde modification.

Les bactéries génétiquement modifiées présentent-elles un risque?

Trois questions sont régulièrement posées :

* Les techniques de modification génétique sont-elles fiables ?

Les techniques développées à l'INRA sont basées sur des processus cellulaires qui se produisent naturellement chez les bactéries (recombinaison homologue et transposition). Elles sont utilisées en laboratoire depuis plusieurs années et produisent des modifications définies, prévisibles et vérifiables. Nous pouvons l'affirmer car des contrôles permettent de s'assurer, d'une part que la modification est bien celle désirée, d'autre part, que la souche modifiée a bien perdu l'ADN indésirable (plasmide, gène de sélection, région non modifiée). Ainsi, est-il possible de modifier une souche sans y ajouter aucun ADN étranger à l'espèce (gènes de résistance aux antibiotiques ou autres). Néanmoins, une souche génétiquement modifiée, comme toute autre souche, est susceptible de subir ultérieurement des remaniements naturels qui sont eux imprévisibles.

* Des modifications génétiques peuvent-elles avoir des effets secondaires ?

Toute altération génétique, par des techniques "recombinante " ou naturelles, peut avoir des effets secondaires. Ainsi, une bactérie modifiée ou naturellement résistante à une température élevée peut présenter une croissance affectée dans d'autres conditions de culture. Aujourd'hui, nous ne pouvons pas prédire si une modification aura des effets secondaires, ni s'ils seront gênants pour l'exploitation de la souche modifiée. C'est pourquoi, le comportement des souches modifiées est d'abord étudié en laboratoire. De plus, en France avant toute utilisation, même en laboratoire, une autorisation doit être obtenue auprès de deux commissions qui évaluent, au cas par cas, le risque potentiel lié aux nouvelles souches.

* Pour une modification, quel risque ?

Pour discuter des conséquences et des risques éventuels des modifications par échange génétique, il est important de considérer la nature de la modification réalisée. La modification de gènes, déjà présents dans la souche ou chez des souches de la même espèce, semble présenter moins de risques que l'introduction de gènes d'espèces différentes ou la modification complète d'une activité enzymatique. Cependant, on ne peut tirer aucune règle générale et l'examen au cas par cas des modifications semble, à ce jour, la meilleure approche.

Conclusion

Précisons qu'aucun produit laitier contenant une bactérie lactique génétiquement modifiée n'est actuellement sur le marché. Les souches génétiquement modifiées qui pourraient arriver sur le marché seraient plutôt des souches industrielles rendues plus performantes ou mieux adaptées au processus industriel dans lequel elles sont utilisées. Il s'agit donc de moduler des activités déjà présentes dans le répertoire génétique de l'espèce et non de créer de toutes pièces de nouvelles souches.
Les bactéries lactiques sont utilisées depuis des siècles pour réaliser des produits alimentaires traditionnels auxquels sont associés les images de produits sains, comme c'est le cas pour les produits laitiers fermentés. Conscients de leurs responsabilités, les industriels comme les scientifiques, tiennent à maintenir la qualité et la sécurité de ces produits.

[R] Pour en savoir plus

Maguin E., Gruss A.,1995. The recombinant taste of cheese. International Dairy Federation Nutrition Newsletter. 143 : 27-29.

Maguin E., Prévost H., Gruss A.,. 1996.Construction of food grade mutants of lactic acid bacteria. Lait. 76 : 139-146.

F. Rallu, A. Gruss, E. Maguin. 1998. Mutants de Lactococcus lactis résistants à l'acidité.Lait. 77 : 131-137.

[R] Transgénèse animale : les recombinaisons homologues

L'addition d'un gène à un organisme entier consiste à lui ajouter une information génétique nouvelle et donc essentiellement à lui conférer un caractère phénotypique nouveau. À l'inverse, il est également possible d'inactiver un gène et ainsi de supprimer une information génétique spécifique. Plus subtilement, il est souhaitable dans certains cas de remplacer un gène fonctionnel par une autre version de ce gène plus ou moins mutée ou par un autre complètement différent. Les techniques pour atteindre ces buts sont disponibles depuis dix ans chez la souris et en partie seulement chez les animaux domestiques.

Louis-Marie Houdebine
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, INRA Jouy-en-Josas

L'addition de gènes

L'addition d'un gène à un génome est possible spontanément dès lors que ce gène a été introduit d'une manière ou d'une autre dans une cellule. L'introduction d'un gène peut se faire par microinjection, par transfection, ou par infection à l'aide de vecteurs viraux désarmés. Si la cellule est un embryon au stade d'une cellule, c'est l'organisme entier dérivé de cet embryon qui portera le gène supplémentaire. La fréquence d'intégration du gène étranger dans le génome d'une cellule est faible. Elle se fait dans la très grande majorité des cas (99,9 %) grâce à l'intervention d'un mécanisme naturel de réparation de gènes.

L'intégration du gène étranger se fait en grande partie de manière aléatoire. Ceci à plusieurs conséquences potentielles. Dans beaucoup de cas, le transgène subit l'influence des gènes qui se trouvent dans son voisinage. L'expression du transgène peut s'en trouver perturbée. Elle peut être nulle ou au contraire très élevée ou non spécifique.

Le transgène peut s'intégrer à l'intérieur d'un des gènes de son hôte et l'inactiver. Cet événement n'est pas très fréquent dans la mesure où les gènes fonctionnels représentent seulement 5 % des génomes animaux. L'inactivation d'un gène de l'hôte conduit dans certains cas à une mort précoce des embryons ou des foetus ou à une altération de telle ou telle fonction biologique.

Malgré ces inconvénients, l'addition de gènes à des animaux est un outil d'étude irremplaçable pour les biologistes. Elle permet également d'obtenir des lignées d'animaux producteurs de médicaments, de cellules ou d'organes utilisables pour l'homme. Elle peut conduire à l'établissement de lignées d'animaux domestiques présentant des caractéristiques génétiques nouvelles intéressantes. Ces lignées d'animaux encore très peu nombreuses ne pourront être utilisées qu'après un examen minutieux des effets secondaires éventuels des transgènes.

Le remplacement des gènes par recombinaison homologue

Lorsqu'une cellule reçoit un fragment d'ADN étranger dont certaines régions sont semblables à une partie de son propre génome, l'ADN étranger peut prendre la place du gène correspondant de son hôte. C'est la «recombinaison homologue».Ce phénomène est très fréquent chez la levure, rare chez les animaux (0,1 % des cas) et à peu près inexistant chez les plantes.

La recombinaison homologue permet donc dans une cellule de remplacer très précisément un gène actif par un gène inactif ou par un tout autre gène. Le remplacement de gène à l'échelle d'un animal entier est possible si la cellule dans laquelle a eu lieu la recombinaison homologue peut être à l'origine du développement d'un embryon. Les cellules embryonnaires souches (ES) ou primordiales germinales (EG) sont totipotentes. Elles peuvent donc participer à la génération d'un animal, après avoir été introduites à un stade précoce du développement d'un embryon. En pratique, des cellules ES fonctionnelles ne permettent ces opérations que chez la souris. Des lignées de cellules ES de poulet obtenues récemment à l'INRA devraient permettre l'extension de ces techniques à cette espèce animale.

Le clonage des embryons par transfert de noyau des cellules foetales ou adultes cultivées dans des ovocytes énucléés permet d'ajouter et de remplacer des gènes chez toutes les espèces où le clonage est possible. Le transfert de gène a lieu pendant la culture des cellules et les noyaux de ces cellules servent ensuite pour engendrer des animaux.

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