____________________________________________________________________________________________

Maladie de la vache folle, maladies à prions :
actualités scientifiques et enjeux de société

____________________________________________________________________________________________

Dossier réalisé à l'occasion d'un colloque
au Salon International de l'Agriculture 2001
(mardi 20 février 2001)

En 1996, le ministre de la santé britannique annonce la transmission vraisemblable à l'homme d'une maladie qui a été observée depuis 1985 dans le cheptel bovin britannique, l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Cette maladie appartient au groupe des Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST) : elles se caractérisent par une longue phase d'incubation, par l'absence de réaction immunitaire qui complique le diagnostic, l'absence de traitement, et une issue fatale. Ces maladies sont connues respectivement chez le mouton sous le nom de tremblante depuis le XVIIIe siècle, pour lequel aucun cas de transmission à l'homme n'a été répertorié, et chez l'homme depuis 1920, sous le nom de maladie de Creutzfeldt-Jakob. De l'agent infectieux probable, on est loin de tout savoir. L'hypothèse la plus couramment admise est qu'il s'agit d'une protéine, appelée "prion", normalement présente dans l'organisme, susceptible, dans certaines conditions, de devenir infectieuse, de se transmettre d'un organisme à un autre et de s'y développer jusqu'à l'apparition de la maladie.

Un dispositif national de recherche
Les inconnues sont nombreuses et ont justifié, en terme de protection des consommateurs et plus largement de santé publique, la mise en place, depuis 1996 plus particulièrement, de nombreuses mesures de précaution recommandées par le comité Dormont et, depuis novembre 2000, d'un nouveau train de mesures : allongement de la liste des tissus potentiellement infectés désormais retirés de la chaîne alimentaire, extension de l'interdiction des farines animales aux porcs et aux volailles, interdiction appliquée jusqu'alors aux bovins et aux autres ruminants, et généralisation sur l'ensemble du territoire des tests de dépistage de l'ESB à tous les bovins de plus de 30 mois entrant dans la chaîne alimentaire.

Parallèlement, le dispositif national de recherche, mis en place autour du ministère chargé de la recherche en 1996, sera renforcé en 2001, qui verra le budget consacré aux EST tripler (70 à 210 MF). Il s'inscrit également dans une coopération européenne accrue. D'ores et déjà, la forte mobilisation des organismes de recherche publique (CEA, CNRS, INRA, INSERM, Institut Pasteur) a permis des avancées importantes : meilleure connaissance de la protéine prion et construction d'outils de recherche communs.

La place originale de l'INRA
L'INRA, organisme de recherche qui se situe à l'interface des professionnels de l'élevage et des consommateurs occupe une position particulière dans ce dispositif. Un partage des tâches entre le CNEVA (1) et l'INRA en 1994, alors que le nombre de cas d'ESB en France était faible, avait conduit le CNEVA à s'intéresser plus spécifiquement aux bovins tandis que l'Institut continuait à approfondir l'étude de la tremblante du mouton. Cette maladie constitue en effet un modèle performant d'étude des EST pour le suivi de la progression de la maladie dans l'organisme, la mise en lumière des facteurs génétiques déterminant la résistance ou la sensibilité des individus à l'infection et les modes de transmission à l'intérieur d'une même espèce ou entre espèces différentes.

La biologie de la maladie
Les observations faites sur le troupeau ovin expérimental de l'INRA, atteint en 1993 par une épidémie de tremblante, ont ainsi permis de progresser dans la compréhension des conditions d'apparition et d'évolution de la maladie et de son mode de transmission.
Ces recherches qui associent généticiens et pathologistes ont notamment porté sur le déterminisme génétique de la maladie. Les résultats acquis donnent lieu déjà à un programme pour la sélection de moutons résistants à l'infection.
Toujours dans le domaine de la biologie de la maladie, des travaux récents sur des agneaux ont autorisé des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes de progression de la maladie dans la phase silencieuse, et en particulier d'établir que le système lymphoïde associé à l'intestin joue un rôle de porte d'entrée de l'infection.

L'INRA a participé également à la mise au point de modèles animaux pour l'étude de la maladie : des souris transgéniques exprimant le gène de la protéine prion du mouton ou du bovin, capables de développer la maladie dans des délais raccourcis de près d'un an par rapport aux souris classiques, ont ainsi été créées. Ces modèles sont un outil essentiel pour mieux comprendre comment la maladie se développe dans l'organisme et étudier le phénomène de transmission inter-espèces et pour tester l'infectiosité de différents organes. Ces souris sont, en outre, à l'origine de cellules mises en culture, ce qui permet d'étudier les conséquences de l'infection sur la physiologie de la cellule ou, pour certains tests, d'éviter l'inoculation de la maladie à l'animal lui-même.

Les recherches portent également sur la mise au point d'outils de diagnostic sur animal vivant en l'absence de signes cliniques, qui n'existent pas actuellement. Deux voies notamment sont actuellement explorées : élaboration de réactifs et anticorps à partir de la protéine normale purifiée produite par l'organisme, capables de révéler la maladie dans sa phase d'évolution silencieuse ; recherche dans le sang ou les urines d'indicateurs biochimiques dont le niveau serait perturbé par la maladie, en l'absence de tout signe clinique.

L'INRA a mis en place des collaborations avec l'AFSSA pour travailler de concert sur l'analyse du nombre de cas et de l'évolution de la tremblante et de l'ESB.

Les farines animales interdites
L'un des axes de recherche du programme national a trait à l'élimination des farines et graisses animales - ce sont 870 000 tonnes de farines et de graisses produites annuellement qui devront être stockées et détruites - et pour lesquelles il n'existe pas dans l'immédiat de capacité d'incinération. L'INRA se trouve particulièrement concerné par ce thème. Dans un premier temps, l'objectif est de rendre ces matériaux biologiquement et chimiquement inertes pour qu'ils puissent être stockés sans risque en décharge de déchets industriels. Des équipes associant des compétences en chimie des protéines et des lipides, en microbiologie appliquée aux fermentations, se mettent à l'œuvre. A plus long terme, des voies de valorisation industrielle (additifs de carburant, matériau destiné aux travaux publics) seront explorées.

Autre problématique de recherche indirectement liée à l'ESB : l'alternative à l'utilisation des farines animales, riches en protéines, dans l'alimentation des porcs et des volailles, même si avant la suspension de leur utilisation, l'emploi de farines carnées demeurait limité en proportion (2 à 3% de l'alimentation totale). L'INRA travaillera également sur les conditions d'extension de cultures d'oléoprotéagineux et de protéagineux, sources de protéines pour l'alimentation animale.

L'INRA dans le débat social
Enfin, l'enjeu collectif que représentent la compréhension des événements récents, l'évaluation et la gestion des risques, ne peut laisser l'INRA indifférent. Comment définir cette crise ? Quels en sont les acteurs ? Comment a-t-elle été gérée dans les différents pays touchés par l'ESB ? Ces questions sont traitées par une équipe de sciences sociales de l'INRA. Dans le même esprit, l'INRA accueille le forum électronique de discussion et d'information sur l'ESB qui compte quelque 600 abonnés. Ce lieu d'échange entre scientifiques, journalistes, professionnels, associations et consommateurs s'affirme comme un forum représentatif du débat dans la société civile.

Au total, ce sont une vingtaine d'équipes de recherche regroupant généticiens, pathologistes, immunologistes, virologues, chimistes, sociologues, qui se trouvent engagées dans 10 programmes européens de recherche et dans des programmes nationaux.

La position de l'INRA, organisme public de recherche finalisée, en prise avec les demandes d'utilisateurs divers de ses recherches, et ses compétences reconnues dans les domaines de la santé animale et de l'alimentation, lui font obligation d'une politique scientifique d'envergure et de transparence sur la nature et la portée des travaux qu'il conduit, à la croisée de la biologie, de l'alimentation et de la santé.

(1) - Centre national d'études vétérinaires et alimentaires, intégré en 1998 à l'Agence françaisse de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA).

La tremblante du mouton est la première décrite des "maladies à prions". Les animaux atteints, après une phase d'incubation qui dure de 15 à 18 mois, présentent une dégénération des neurones du système nerveux central (cerveau, moelle épinière), provoquant des troubles de mobilité et de comportement. A l'autopsie, le tissu cérébral présente des dépôts typiques d'une protéine anormale, le prion pathogène, qui est la marque de toutes les maladies à prions. On ne connaît aucune guérison naturelle, ni traitement.

La tremblante : un risque pour l'Homme ?
D'abord un problème de santé animale, puisque très répandue en Europe (dont la France), la tremblante est une maladie "familière" des éleveurs dans certaines régions où elle sévit depuis des temps reculés. Les études réalisées à ce jour concluent à une absence de risque direct de la tremblante "classique" pour l'homme. Cependant parmi les hypothèses sur l'origine de l'épidémie d'ESB au Royaume-Uni, figure celle d'un passage du prion ovin au bovin par le biais des carcasses de mouton recyclées en farines. A l'inverse, on ne peut pas éliminer l'hypothèse de l'infection récente de moutons par le prion de l'ESB, via des farines animales contaminées. Ces raisons militent en faveur de l'éradication de la tremblante ovine, décrétée en Angleterre, et en cours en France.

Les tremblantes du mouton
Certes il n'y a pas UNE mais DES tremblante(s). On sait qu'il existe différentes souches de tremblante, en nombre indéterminé et aux caractéristiques distinctes (1) ; en revanche, il n'existe qu'une souche d'ESB identifiée à ce jour. Le mouton présente des degrés de résistance variables à la tremblante. Cette sensibilité héréditaire est déterminée par des transformations précises du gène qui est à l'origine de la synthèse du prion "normal". Ainsi certaines races de moutons sont totalement résistantes à la plupart des souches de tremblante. Il faut noter que chez le bovin, il n'y a pas de variabilité connue dans la sensibilité à l'ESB. On connaît également chez l'homme des prédispositions génétiques qui rendent plus sensible à la nouvelle forme de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (nvMCJ).

Un bon modèle pour la recherche
L'INRA, depuis 1994-95, travaille essentiellement sur cette pathologie, et pas seulement à des fins d'éradication. En effet, parmi les maladies à prions, la tremblante, outre qu'elle est "l'ancêtre", présente comme modèle de recherche un certain nombre d'avantages. Par "modèle", on veut dire qu'elle constitue un exemple sur lequel il est possible de conduire des expériences scientifiques, pour produire des connaissances applicables aux maladies à prions de toute espèce, de l'espèce humaine en particulier.

Les "variantes" évoquées précédemment (souches d'agent, mutations connues chez le mouton) font de la tremblante un modèle riche en possibilités d'étude de relations "cause à effet" : par exemple, l'étude comparée des propriétés de la protéine prion portant le caractère de résistance et celles de sa forme sensible est une voie possible vers la compréhension non seulement du déterminisme de la résistance génétique, mais aussi du mécanisme de la conversion du prion normal en prion pathogène.

En outre, pour les recherches en pathologie, qui s'attachent à comprendre notamment les voies de propagation du prion infectieux dans l'organisme, la tremblante "classique" est également un bon modèle : en effet chez le mouton atteint de tremblante ou infecté expérimentalement par l'ESB, on assiste à une dissémination de l'agent dans de nombreux organes comme la rate, le thymus, les ganglions, les amygdales, organes dits "lymphoïdes". Il semble de ce point de vue que les EST ovines diffèrent de l'ESB, mais ressemblent au nvMCJ chez l'homme. Le mouton pourrait en particulier servir de modèle pour la mise au point de tests de dépistage précliniques (à partir du sang, par exemple) applicables au diagnostic du nvMCJ.

Enfin le modèle tremblante, certes plus lourd que les modèles sur petit rongeur, est beaucoup plus léger, économique et sûr (pour l'expérimentateur) que le modèle de l'ESB. Toutefois, dire que la tremblante est un bon modèle de recherche ne signifie pas que les toutes les expérimentations sont faites sur mouton, loin s'en faut. En particulier, l'utilisation de souris ou de cellules auxquelles on a transféré des caractéristiques spécifiques du mouton par greffage du gène du prion ovin reste la voie royale pour l'étude de l'agent infectieux, pour le diagnostic, ainsi que pour des essais de molécules thérapeutiques anti-prion.

Pour conclure, on doit constater que les travaux menés par l'INRA sur ce modèle, constituent déjà un apport important à l'ensemble des recherches conduites en France sur les maladies à prions.

(1) - en l'occurence : la durée d'incubation (en jours) et le "profil lésionnel" (nombre de "trous" dans des zones identifiées du cerveau) obtenus quand on les injecte à des souris.

Entretien avec Human Rezaeï
Jeune chercheur physico-chimiste


Human Rezaeï a 29 ans. De nationalité iranienne, il est marié à une Française et vit en France depuis 16 ans. Après une maîtrise de Biochimie à l'Université Paris 6, il fait une spécialisation de Biophysique puis un DEA de Biologie et de Biophysique au Muséum national d'histoire naturelle. En janvier 1998, l'INRA lui accorde une bourse de thèse pour travailler sur le prion. Il est intégré au projet de recherche, conduit en collaboration par trois équipes de l'INRA, visant à comparer les propriétés physico-chimiques des différentes formes génétiques de la protéine prion ovine, leur propension à s'associer à d'autres composants biologiques, tout ceci dans le but de comprendre les bases moléculaires du lien entre la structure de la protéine et la sensibilité à la tremblante.


Quel était votre sujet de thèse ?
La question posée était la suivante : peut-on mettre en évidence des caractéristiques physiques ou chimiques de la molécule prion normale qui expliqueraient les différences de résistance à la tremblante ? Ce travail s'appliquait d'abord à la forme normale, non pathogène, de la protéine prion. A l'INRA, on avait la possibilité d'étudier la protéine prion du mouton qui, à l'inverse de celle des bovins, peut présenter différentes formes. Et on savait déjà que certaines caractéristiques génétiques particulières à chaque race de mouton pouvaient susciter une résistance plus ou moins grande à la tremblante (qui est l'équivalent de l'ESB pour les ovins).

Vous disposiez donc dès le départ de tout ce qu'il vous fallait pour commencer votre thèse ?
Pas du tout. Il a fallu d'abord mettre au point une technique pour purifier la protéine prion du mouton. Ca nous a demandé six mois de travail pour la faire produire par des bactéries et la préparer. J'ai dû mettre au point une technique de purification nouvelle, car celles que l'on connaissait ne produisaient que des fragments de la protéine. Grâce à la technique mise au point, nous avons réussi à obtenir une très grande quantité de protéine prion intacte, sous toutes les formes génétiques rencontrées chez les ovins. Ce que nous avons réussi là a intéressé tous les grands laboratoires qui, en France ou à l'étranger, travaillent sur les maladies à prions, y compris aux Etats-Unis chez Stanley Prusiner (1).

Et qu'avez vous fait ensuite avec tous ces prions ?
Il s'agissait d'étudier les propriétés physico-chimiques des différentes formes de cette protéine. Nous avons travaillé sur deux protéines présentes dans les types de moutons résistants à la tremblante et sur deux protéines issues de types sensibles. Ces deux catégories de prions se sont révélées très différentes.
Nous avons observé que la protéine issue d'un type de mouton très sensible se présentait sous une forme très stable et compacte, à la différence de la forme liée à la résistance, moins stable. Or, d'après les thèses de Prusiner, la protéine la plus stable aurait dû être plus difficile à transformer en forme pathogène de prion.

Et comment expliquez-vous ce paradoxe ?
Nous avons poursuivi la recherche en chauffant la protéine de façon à observer comment elle se transformait sous l'effet de la chaleur. Nous nous sommes ainsi rendu compte que la protéine issue d'un type sensible évoluait, à une certaine température, vers un stade intermédiaire irréversible qui lui donnait subitement des caractéristiques particulières qui pouvaient permettre le changement de forme du prion ; la protéine "sensible" présentait, de façon tout à fait inattendue, deux des caractéristiques du prion pathogène alors que la forme "résistante" soumise au même traitement n'acquiert pas les propriétés pathogènes. La chaleur, dans notre expérience, fournit l'énergie nécessaire à la transformation qui, dans la cellule vivante, peut être réalisée par des composants facilitant ces modifications. Nous avions de cette façon démontré pour la première fois qu'une différence de propriétés physiques et chimiques au niveau des molécules de protéine prion pouvait expliquer la différence de résistance à la maladie des animaux.


Quelles sont les conséquences d'une telle découverte ?
Ce travail montre d'abord tout l'intérêt qu'il y a à travailler sur le mouton pour mieux comprendre comment fonctionne le prion. Ce type de travail s'appuie sur la physico-chimie et la biologie structurale : j'ai pu le réaliser parce que j'ai été accueilli dans des laboratoires dont la diversité de compétences ainsi que l'engagement m'ont soutenu. L'intérêt de ces résultats a été remarqué lors d'un récent congrès par les plus grands spécialistes mondiaux. "Push, push !" m'a dit Stanley Prusiner. En effet, à partir de cette recherche, d'autres travaux, sur le prion pathogène ou sur le prion bovin, devraient nous permettre de mieux comprendre ce qui conduit un prion normal à devenir pathogène. Et, à terme, on peut espérer que ce type de travail pourrait contribuer à aider les chercheurs qui étudient les moyens de soigner les maladies à prion.

(1) - Prix Nobel 1998 pour l'ensemble de ses travaux sur le prion.

La Tremblante ovine se transmet "naturellement" au sein des élevages contaminés, ce qui a permis aux équipes de l'INRA (1) de suivre la progression de la pathologie de la naissance à l'apparition des signes cliniques sur des lots d'agneaux nés et élevés dans le domaine expérimental de Langlade, près de Toulouse.

Tant que les troubles ne sont pas apparents, la seule marque de l'infection (sa signature) est la conversion de la protéine prion normale de l'animal en une forme pathologique. On "trace" donc le prion en recherchant cette protéine transformée dans les organes susceptibles de servir de relais entre la porte d'entrée de l'agent infectieux et le système nerveux central, siège des signes terminaux de la maladie. Comme ces organes contiennent beaucoup moins de protéine prion que le cerveau, il faut disposer de moyens de détection très sensibles et d'une méthode permettant de repérer spécifiquement la forme pathologique.
Les chercheurs ont eu recours à des techniques qui permettent de visualiser les cellules dans lesquelles la protéine prion est présente, et ont mis au point un traitement des tissus qui permet de détruire la forme normale et de préserver la forme pathologique, plus résistante, qu'on peut alors "marquer" de manière spécifique avec un anticorps très puissant produit à l'INRA.

En examinant systématiquement les tissus du tube digestif, du système immunitaire (nœuds lymphatiques, amygdales, plaques de Peyer, du système nerveux périphérique et central, les chercheurs ont pu établir que la voie principale de l'infection est orale, et que le système lymphoïde associé à l'intestin joue un rôle particulier de porte d'entrée de l'infection ; le franchissement de l'interface entre système immunitaire intestinal et système d'innervation local permet la propagation vers le système nerveux central. Tant que ce dernier n'est pas atteint, l'animal ne présente pas de signes cliniques : c'est la phase silencieuse de l'incubation.
Ces études ont montré que les agneaux génétiquement sensibles à la maladie sont très précocement contaminés : dès l'âge de 2 mois, la protéine pathologique est décelable dans l'intestin et vers l'âge de 9 mois, elle est détectée au niveau du système nerveux central. Ces animaux ont développé les signes cliniques à 18 mois. Aucune trace de protéine pathologique n'a pu être décelée chez les agneaux génétiquement résistants.

Cette étude renseigne sur ce qui peut se produire lors de la contamination alimentaire des bovins, ou des humains. Elle se distingue des infections expérimentales pratiquées sur des souris ou des hamsters par injections intra-crâniennes, qui ne simulent donc pas les voies naturelles de contamination.
La poursuite de l'analyse fine des mécanismes de dissémination sur la voie analysée par les chercheurs de l'INRA peut déboucher sur des pistes thérapeutiques propres à empêcher la pénétration du prion et donc permettre d'intervenir avant l'invasion du système nerveux central et l'apparition des troubles neuronaux caractéristiques de la maladie.

(1) - Station d'Amélioration génétique des animaux, Toulouse ; Unité de Pathologie infectieuse et immunologie, Tours ; Unité de Physiopathologie infectieuse et parasitaire des ruminants, ENV Toulouse ; Unité de Virologie et immunilogie moléculaires, Jouy-en-Josas ; Institute for Animal Science and Health, Lelystad, Pays-Bas.

Vous travaillez à l'INRA depuis 1982. Pouvez-vous nous retracer votre parcours ?
Je suis entrée à l'INRA, au centre de recherche de Tours, juste après mes études universitaires. J'ai commencé à travailler sur la physiologie du système immunitaire de la glande mammaire de truie et sur les mécanismes de protection des nouveaux-nés par le lait maternel vis-à-vis de la Gastroentérite transmissible porcine. J'ai à cette occasion complété ma formation initiale de microbiologie en suivant le cours d'immunologie de l'Institut Pasteur et en réalisant une thèse de 3e cycle en endocrinologie. En 1991 j'ai rejoint, à l'Unité de Pathologie infectieuse et immunologie, une équipe qui étudiait les mécanismes génétiques et immunitaires de la résistance innée des ruminants domestiques aux maladies infectieuses. En 1994, dans le cadre du redéploiement des compétences à l'INRA pour répondre aux besoins de recherche sur les EST, notre groupe s'est réorienté et, depuis cette date, je me consacre entièrement à l'étude des interactions de l'agent de la tremblante avec le système immunitaire des ovins.
Tout au long de ma carrière scientifique, je me suis intéressée aux interactions entre l'agent pathogène et le système immunitaire des animaux domestiques. Par ailleurs, j'ai toujours privilégié l'étude, basée sur l'immunohistochimie, des interactions hôte/pathogène au niveau des organes mêmes des animaux malades.

Pouvez-vous définir ce terme d'immunohistochimie ?
Il s'agit d'établir une sorte de cartographie de la présence de l'agent pathogène dans des tissus infectés en le repérant à l'aide d'anticorps. En pratiquant des abattages d'animaux sains et malades, à intervalles réguliers, nous pouvons suivre l'évolution de la maladie en révélant la présence de l'agent pathogène dans les différents tissus et en observant les modifications quantitatives et qualitatives des différentes catégories de cellules qui constituent ces tissus. Cette méthodologie a pris une place prépondérante dans l'étude du développement des pathologies non conventionnelles que sont les EST.

Quel est précisément votre sujet d'étude ?
J'étudie les phases précoces du développement de la tremblante naturelle chez les ovins. Celles-ci correspondent à la longue période d'incubation au cours de laquelle l'agent infectieux se multiplie dans le système immunitaire, avant d'atteindre le cerveau où il provoque une dégénérescence neuronale responsable de l'apparition des signes cliniques. Notre groupe s'intéresse aux voies d'entrée et de propagation de l'agent dans l'organisme, en fonction de la sensibilité génétique de l'hôte à la maladie.
Ma spécialisation en immunohistochimie me permet en outre de travailler avec d'autres équipes de l'INRA et du CEA à la mise au point d'outils de diagnostic (anticorps spécifiques de l'agent des EST) de la tremblante. L'utilisation des anticorps retenus a été ensuite optimisée en collaboration avec l'Ecole nationale vétérinaire de Toulouse (ENVT).

Quelles sont les avancées en matière de connaissance de la maladie ?
Les premiers résultats, obtenus à partir de notre troupeau expérimental, ont montré que les agneaux génétiquement sensibles s'infectent très tôt, par voie orale.
L'agent de la tremblante est présent au niveau des formations lymphoïdes de l'intestin dès l'âge de 2 mois, suggérant que ces formations assurent le rôle de porte d'entrée dans l'organisme. Entre 3 et 6 mois, l'agent se propage préférentiellement dans le système immunitaire du tube digestif, dont les amygdales. Dès 9 mois, l'ensemble du système immunitaire est contaminé de manière identique, seul le thymus reste négatif, et l'agent peut être détecté dans le système nerveux du tube digestif ainsi qu'au niveau du bulbe rachidien. L'atteinte du cerveau semble se réaliser par l'intermédiaire des fibres nerveuses du tube digestif. Ces animaux ont présenté les signes cliniques de la maladie dès l'âge de 18 mois.

Décrivez-nous concrètement votre travail.
A l'INRA de Tours, nous travaillons sur des animaux infectés, ce qui nous oblige à respecter des règles de sécurité très strictes. Les bâtiments d'élevage et le laboratoire sont placés en conditions de confinement et équipés de manière à éviter tout risque de contamination vers l'extérieur. Pour ce qui concerne les travaux sur l'infection naturelle, nous entretenons une collaboration étroite avec l'équipe du Département de Génétique animale de l'INRA à Toulouse et l'ENVT. Nous avons la chance de pouvoir étudier la maladie "grandeur nature" grâce au troupeau du domaine expérimental de Langlade, près de Toulouse, qui compte un millier de brebis Romanov. Nous nous rendons fréquemment à Toulouse pour effectuer à l'ENVT les prélèvements sur animaux naturellement infectés. Au cours de ces deux dernières années, nous avons autopsié une centaine de moutons ; sur chacun, nous avons prélevé plus de cinquante échantillons d'organes (systèmes nerveux central et périphérique, organes lymphoïdes, tube digestif), destinés à une détection immunohistochimique de l'agent de la tremblante. C'est un travail long et fastidieux d'inclusion des prélèvements en paraffine, de réalisation de coupes de tissus de quelques microns d'épaisseur, puis de marquage des molécules recherchées à l'aide d'anticorps spécifiques. Les résultats sont obtenus par une lecture des coupes de tissus en microscopie optique.

Quelles sont vos relations avec les collègues d'autres disciplines, les généticiens notamment, ou d'autres organismes ? Comment travaillez-vous ensemble ?
Nous avons une longue tradition de collaboration avec nos collègues généticiens. Par ailleurs, chaque laboratoire s'est spécialisé dans certains domaines d'approche du sujet. Le laboratoire de virologie de Jouy-en-Josas, par exemple, produit des réactifs (anticorps spécifiques de la protéine prion) afin de mieux définir les propriétés biochimiques de cette molécule. En participant à la caractérisation de ces réactifs que nous testons sur des tissus infectés, notre laboratoire peut en bénéficier en retour pour ses études sur le développement de la maladie. Nous avons donc de fréquents contacts avec les autres équipes et des réunions de bilan, à l'initiative de l'Institut, nous rassemblent régulièrement.
Une collaboration entre les différents organismes de recherche français a par ailleurs été largement développée, depuis 1997, grâce à un financement de projets de recherche par la Cellule de coordination interorganismes. Notre laboratoire s'intègre dans un programme en réseau avec l'Hôpital La Pitié-Salpetrière, l'Ecole nationale vétérinaire d'Alfort et le CEA pour la caractérisation de réactifs pour différentes espèces : l'homme, les bovins et les ovins, ce dernier point étant traité par nous.

Comme pour beaucoup de pathologies survenant naturellement dans les espèces animales d'élevage (ou a fortiori dans l'espèce humaine), il est commode de disposer d'un modèle expérimental (petits animaux de laboratoire) permettant de reproduire dans des conditions contrôlées tout ou partie des étapes de la maladie. Cela permet de mieux comprendre le mécanisme de la maladie et de tester des voies de traitement ou de prévention.

Dans le cas des maladies à prions, l'inoculation expérimentale se heurte à plusieurs obstacles : les seules sources d'agent infectieux sont les organes bruts d'un animal malade, le cerveau en général, dont un broyat peut être inoculé directement dans le cerveau d'un animal receveur ; mais le phénomène de "barrière d'espèce" (1) limite fortement l'efficacité de transmission, et le délai nécessaire à l'apparition de premiers signes cliniques dans l'espèce receveuse peut être très long ; enfin cette efficacité semble dépendre de la souche de tremblante utilisée. Les travaux d'équipes étrangères ont montré que le franchissement de cette barrière est facilité par la ressemblance au niveau moléculaire entre les protéines prions normales de chacune des espèces concernées. D'où l'idée de modifier génétiquement des souris, pour qu'elles expriment non plus la protéine prion propre à leur espèce, mais la protéine du mouton, et d'étudier si elles pourraient devenir alors particulièrement réceptives à l'agent de la tremblante .

Deux équipes de chercheurs de l'INRA (1) se sont associées pour réaliser cette opération, appelée transgenèse, à partir de souris déjà privées de la capacité de produire leur propre protéine prion. Ils ont greffé à ces souris le gène ovin porteur des mutations liées à la plus grande sensibilité à la tremblante. Malgré de nombreuses difficultés, ils ont pu obtenir des lignées d'animaux exprimant dans leur cerveau la protéine ovine à un niveau similaire à celui observé dans un cerveau de mouton normal, et d'autres produisant la protéine ovine jusqu'à huit fois le niveau normal.

Ces lignées ont été soumises à des essais d'inoculation intra-cérébrale de différentes souches de tremblante ovine et ont révélé, par comparaison aux lignées de souris classiques (non transgéniques), une susceptibilité nettement accrue dès le premier essai de transmission, notamment en termes de durée d'incubation, qui se trouve réduite d'environ un an par rapport aux souris conventionnelles.

Les chercheurs de l'INRA disposent ainsi d'un modèle rapide et sensible pour déceler la présence de prions pathogènes, pour analyser la diversité biologique naturelle des souches de tremblante, pour étudier les modalités de la dissémination du prion dans l'organisme selon la voie d'inoculation et pour approfondir les déterminants de la barrière d'espèce. Des lignées de souris similaires sont en voie d'obtention pour l'étude de l'ESB (souris transgéniques exprimant la protéine prion bovine).

(1) - Ce phénomène désigne la difficulté à transmettre à une espèce une pathologie développée de manière transmissible ou contagieuse au sein d'une autre espèce.

(2) - Laboratoire de Génétique biochimique et cytogénétique, Unité de Virologie et immunologie moléculaires, Jouy-en-Josas.

Sensibilité et résistance génétique des ovins à la tremblante
Les généticiens de l'INRA (1) ont établi, en convergence avec les observations d'autres équipes européennes, une étroite relation entre les différences héréditaires de sensibilité à la tremblante observées dans de nombreuses races ovines et des particularités au niveau du gène responsable de la synthèse de la protéine prion du mouton.
Ce gène existe sous plusieurs formes correspondant à autant de variantes de la protéine prion normale. Ces variantes se distinguent par quelques acides aminés, qui sont les composants élémentaires d'une molécule de protéine. C'est de la combinaison des acides aminés présents à certaines positions dans la protéine que résulte une sensibilité variable à la tremblante. Les animaux porteurs de la seule forme dite ARR (2) sont, sans exception à ce jour, résistants à la maladie. Au contraire les animaux porteurs de la forme dite VRQ sont extrêmement sensibles à la tremblante.
Un inventaire des formes génétiques présentes dans les différentes races françaises (3) a montré une grande variabilité inter-raciale. Cette diversité ouvre la voie à la sélection génétique d'animaux résistants dans le but d'éradiquer la maladie.

Quelles perspectives pour l'éradication "génétique" de la tremblante ?
L'éradication de la tremblante fondée sur des stratégies d'abattage et de désinfection a le plus souvent conduit à des échecs, du fait de la longue persistance de l'agent infectieux dans le milieu d'élevage. Puisque les ovins homozygotes ARR/ARR (4) apparaissent toujours résistants dans des environnements très contaminés, une éradication de la tremblante par sélection génétique semble possible.
Une condition est toutefois requise pour s'engager dans cette stratégie. Un animal résistant, ne présentant jamais de signes cliniques, pourrait être porteur de l'agent infectieux sans en être lui-même affecté et pourrait le disséminer vers des congénères sensibles ou par franchissement de la barrière d'espèce : c'est ce que l'on appelle un porteur sain. L'ensemble des informations disponibles à ce jour, à travers les recherches conduites par l'INRA ou dans d'autres pays européens, indiquent que les ovins résistants de génotype ARR/ARR ne présentent pas le risque d'être des réservoirs ou des diffuseurs de l'agent de la tremblante.
Par ailleurs, face aux incertitudes sur les passages du prion pathogène entre bovins et ovins, il est important de s'assurer que les moutons résistants à la tremblante ne deviennent pas des réservoirs du prion bovin. Les observations enregistrées à ce jour indiquent que les animaux résistants à la tremblante sont également résistants à toute contamination par l'agent de l'ESB, sans par ailleurs être des porteurs sains.

Compte tenu de ces relatives certitudes, les généticiens de l'INRA proposent de remplacer progressivement les animaux sensibles par des animaux génétiquement résistants. Les mesures d'abattage appliquées dans les élevages les plus atteints par la tremblante pourraient évoluer en combinant abattage, repeuplement et gestion du renouvellement à partir d'animaux génétiquement résistants. Une application de ces recommandations limitée à quelques populations devrait être soumise à évaluation, avec un suivi précis de l'incidence des cas cliniques, avant leur généralisation.

(1) - Station d'Amélioration Génétique des Animaux, Toulouse.
(2) - Du nom des acides aminés présents aux positions 136, 154 et 171 : Alanine (A), Arginine (R), Valine (V), Glutamine (Q).
(3) - Ce "génotypage" est réalissé par GIE LABOGENA, Jouy-en-Josas.
(4) - Tout animal porte deux copies de chacun de ses gènes ; lorsqu'elles sont identiques l'animal est dit homozygote pour ce gène ; il est dit hétérozygote dans le cas contraire.

L'épidémiologie analyse les maladies à l'échelle des populations, humaine ou animales. En matière d'EST, elle constitue un outil pour mesurer l'ampleur de l'épidémie d'ESB sur le cheptel et les types de populations à risque (année de naissance, région d'origine, type d'abattage). Elle aide aussi à mieux cerner les sources et voies de transmission des EST entre animaux, pour mieux les contrôler. C'est l'étude épidémiologique menée par l'équipe de John Wilesmith en Grande-Bretagne en 1988 qui a permis la première de pointer les farines animales comme source probable de la contamination par l'ESB.

Une approche pluridisciplinaire et un réseau de recherche structuré
L'ESB, et les EST en général, sont par nature difficiles à étudier en épidémiologie : absence de méthode de dépistage avant la fin de la longue période d'incubation, existence, dans le cas de la tremblante, d'une composante génétique associée à la dynamique de la transmission de l'agent pathogène. Le développement des études épidémiologiques sur ces affections associe donc des compétences différentes. A l'INRA (1) , ces travaux, menés de manière pluridisciplinaire, associent épidémiologistes et modélisateurs, généticiens, parasitologues, écologues, biologistes moléculaires et anatomopathologistes. Par ailleurs, l'Institut conçoit et conduit les études épidémiologiques en partenariat étroit avec les épidémiologistes de l'Agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) qui ont, entre autres, en charge la gestion des réseaux de surveillance de l'ESB et de la tremblante.
Ces projets de recherche sont mis en œuvre en partenariat avec les Services vétérinaires et les partenaires de terrain (vétérinaires praticiens, organismes de sélection génétique, groupements d'éleveurs en charge de la santé des animaux).

Avoir une meilleure "mesure" de l'épidémie d'ESB en France
La mise au point des tests dits "rapides" et leur excellente qualité, démontrée par l'étude européenne au printemps 1999, ont ouvert de nouvelles perspectives aux épidémiologistes. C'est ainsi qu'a été conçu le programme pilote dans le Grand Ouest de la France, destiné à évaluer la fréquence des cas d'ESB parmi les animaux morts naturellement, euthanasiés car incurables, ou abattus d'urgence pour cause d'accident. L'INRA a participé à la conception du projet, et collabore actuellement au suivi et à l'analyse des données, aux côtés de l'AFSSA. Les premiers résultats de ce travail, présentés en décembre dernier, indiquent une fréquence d'infection dans la population observée qui se situe dans le haut des estimations faites lors de la conception de l'étude, et mettent en évidence l'atteinte relativement élevée de la catégorie des animaux abattus d'urgence. Ce dernier constat a conduit le gouvernement à décider du retrait de ces animaux de la chaîne alimentaire.
Actuellement, l'INRA s'emploie avec l'AFSSA à analyser, en fonction de l'âge, de la région et des effectifs d'animaux testés…, les chiffres issus du dépistage systématique des bovins à l'abattoir, afin notamment de mesurer l'efficacité des mesures de contrôle de l'ESB mises en œuvre en 1996.

Comprendre l'origine des cas NAIF d'ESB
Une autre question adressée aux épidémiologistes en matière d'ESB est de comprendre l'origine des cas dits NAIF, ces animaux atteints d'ESB et qui sont nés après l'interdiction des farines animales dans l'alimentation des ruminants. Les investigations menées sous l'autorité du Ministère de l'Agriculture nous orientent vers un rôle probable des aliments du commerce dans la contamination de ces bovins, par des contaminations croisées entre aliments destinés aux bovins et aliments destinés aux monogastriques notamment. Une investigation épidémiologique devrait prochainement tester ces hypothèses.

Analyser les voies de transmission de la tremblante
Deux études sont actuellement en cours. La première est conduite sur l'ensemble du territoire français dans 450 troupeaux ovins, parmi lesquels 100 sont des troupeaux atteints de tremblante ; les autres, dits troupeaux témoins, ont été choisis au hasard. L'objectif est de mieux cerner les facteurs de transmission de la maladie d'un troupeau à l'autre, en comparant les pratiques des élevages cas et témoins en matière d'achats d'animaux, d'utilisation des estives ou pâtures collectives, de voisinage, et d'alimentation. L'analyse statistique sera terminée d'ici l'été prochain.
L'autre étude est un suivi sur plusieurs années d'une trentaine d'exploitations ovines des Pyrénées-atlantiques. Elle s'attache à comprendre, à l'échelle du troupeau, les voies de transmission de la maladie entre animaux, notamment le rôle éventuel du parasitisme, des acariens et des rongeurs sauvages dans la dissémination de la maladie, ainsi que les modalités de transmission de la maladie en période d'agnelage, entre adultes et nouveau-nés.
Sur le même thème, des travaux de modélisation sont en cours pour simuler la dynamique d'évolution de l'épidémie dans un troupeau donné ainsi qu'à l'échelle d'une région, à partir du commerce des animaux reproducteurs entre troupeaux et des contacts sur les alpages et les pâturages.

(1) - Unité d'épidémiologie animale, Clermont-Ferrand Theix.

Les travaux sur la sociologie et la gestion publique du risque conduits à l'INRA (1) reposent sur des enquêtes, la constitution de bases documentaires et le suivi chronologique de longues séries d'événements. La reconstruction socio-historique de la "saga de la vache folle" conduit à rassembler et à traiter une grande masse de documents hétérogènes, organisé au sein d'un système d'information, véritable outil de recherche, qui réunit les textes réglementaires, les articles scientifiques et les avis des experts, dans le cadre du programme européen BASES (2).
De plus, la constitution de la liste ESB (un forum sur Internet regroupant des acteurs divers mobilisés par des échanges citoyens et professionnels) a permis de créer un espace de débat original où la nature des risques, le contenu des décisions et le comportement des différents acteurs sont en permanence discutés.

L'analyse rétrospective des événements
Au-delà de la diversité des situations nationales liée à l'étendue de l'épidémie d'ESB, l'analyse comparée de différents pays européens (France, Grande-Bretagne, Pays-Bas, Portugal) permet d'identifier des points communs dans la gestion publique de cette maladie.
. L'ESB a d'abord été considérée comme un problème de santé animale concernant surtout la Grande-Bretagne. Dans les différents pays, on a alors systématiquement minimisé l'impact de cette maladie et, jusqu'en 1996, nié son impact potentiel sur la santé humaine.
. Depuis la fin des années 1980, certains scientifiques avaient pourtant attiré l'attention sur l'hypothèse de transmission de l'ESB à l'homme, mais leurs alertes n'ont eu que des effets marginaux dans la gestion publique du problème, y compris d'ailleurs sur la stimulation des recherches sur les prions qu'il convenait d'engager dès le début des années 1990.
. Les mesures prises (interdiction des farines, premiers retraits des matériaux à risque…) étaient susceptibles d'enrayer le développement de l'épidémie dans les troupeaux, mais leur efficacité a été limitée du fait des difficultés liées à leur mise en œuvre et à leur contrôle.
. La crise de mars 1996, liée à l'annonce de la transmissibilité de l'ESB à l'homme, a poussé les acteurs publics et professionnels à multiplier les mesures de précaution, tout en cherchant à rassurer les consommateurs de viande bovine en relativisant le risque. Mais la crise de 1996 a provoqué une crise de confiance dans les institutions, suscité des enquêtes publiques et abouti à la réforme de l'expertise européenne, qui s'est trouvée soustraite à la Direction générale de l'Agriculture et désormais placée sous l'autorité de la Direction générale chargée de la Consommation.
. La crise française d'octobre 2000 a pris source dans une accumulation de faits (nombre croissant d'animaux contaminés révélés par la campagne de dépistage, incapacité à garantir l'absence totale de farines carnées dans l'alimentation du bétail…), relayée par la presse. Cette crise, aux conséquences radicales pour les filières bovines et l'industrie de l'alimentation animale, a amorcé un véritable redéploiement européen de la gestion publique de l'ESB. Après avoir dé-construit l'Europe, la crise pourrait finalement fournir l'opportunité de sa construction en matière de risques sanitaires et, au delà, conduire à un réexamen de sa politique agricole.

L'identification de problèmes pour la gestion publique des risques
Ces observations conduisent à identifier un problème essentiel pour nos sociétés contemporaines : celui de la communication au grand public de controverses sur la gestion des risques potentiels en situation d'incertitude scientifique. On craint généralement que le déroulement de telles controverses dans l'espace public ne favorise l'inquiétude et la confusion. L'enjeu est alors pour les décideurs comme pour le public de concevoir que, dans le cas de problèmes sanitaires comme ceux que pose l'ESB, la contribution des scientifiques est certes essentielle pour évaluer les risques et aider à les gérer, mais qu'elle ne peut à elle seule asseoir la décision politique.

Des procédures pour augmenter les apprentissages collectifs
La leçon essentielle de ces crises est celle du décalage entre le risque théorique, évalué selon l'hypothèse d'un fonctionnement idéal du système, et le risque réel qui prend en compte les conditions pratiques de terrain. Pour y remédier, il faut envisager de nouveaux dispositifs de consultation et d'expertise collectives associant les différentes parties prenantes, notamment les praticiens de terrain et les consommateurs.

(1) - Collectif sur les risques, la décision et l'expertise (CRIDE), Unité d'économie et sociologie rurales, Grenoble.
(2) - http://www.upmf-grenoble.fr/inra/serd/BASES/report.htm

Les chercheurs doivent être partie prenante du débat social. Les scientifiques de l'Institut engagés dans les programmes de recherche sur les maladies à prions s'y emploient à leur manière avec la liste ESB . Ce forum électronique a vu le jour en mai 1999 à la Mission Environnement et Société de l'INRA.

Tout a commencé par la mise en place d'un site WEB au début 97, qui a permis d'assurer un suivi francophone de l'actualité en matière d'ESB et de maladies à prions. Sur la page "Vache Folle en ligne" hébergée sur le site du Courrier de l'Environnement qu'édite la Mission, ce suivi ne se limitait pas à l'actualité scientifique mais cherchait, au delà, à rendre compte de la façon dont la question des maladies à prions était abordée dans la société, à la fois sur le plan réglementaire, technique, politique et médiatique.

Il est apparu ensuite que le forum anglophone consacré à la "BSE" ne répondait pas aux attentes d'un plus large public francophone ; c'est à partir de ce constat qu'est née la liste ESB.

Elle réunit aujourd'hui près de 600 personnes de tous horizons. On y trouve bien évidemment de nombreux chercheurs travaillant sur le prion, et notamment ceux de l'INRA, du CNRS, du CEA ou de l'INSERM. Mais très nombreuses sont également les personnes travaillant dans les milieux de l'élevage : vétérinaires, éleveurs, ingénieurs et techniciens des organisations professionnelles agricoles, de l'agro-alimentaire et de la filière viande. Un groupe très important de journalistes constitue le troisième pôle de ce forum. Et puis on y rencontre bien sûr aussi de nombreux citoyens préoccupés, en tant que consommateurs, médecins, parents d'élèves, fonctionnaires des services agricoles…, par les problèmes que soulève la "vache folle".

Ils sont tous là pour échanger des informations et des points de vue, mais aussi pour mettre en commun des expériences très diverses et des sensibilités parfois divergentes. C'est ainsi que pendant l'été 2000 la liste ESB a ouvert un débat approfondi sur la question de l'abattage des troupeaux dans lesquels un cas d'ESB a été diagnostiqué. Cet échange a permis la constitution d'un "Dossier de l'ESB" qui est toujours en ligne sur le site du Courrier de l'Environnement.

La crise qui a commencé en octobre 2000 a suscité un afflux de nouveaux abonnés et des débats souvent très vifs ont exprimé sur ce forum les tensions qui, au même moment, ont traversé la société française toute entière.

Certes au moment où ces lignes sont écrites, il est encore trop tôt pour annoncer la fin de cette crise. Toutes les répercussions sociales et économiques n'en sont pas encore évaluées pleinement ; la campagne de tests systématiques des bovins de plus de 30 mois réserve encore bien des incertitudes et la question du traitement des farines exclues de la fabrication des aliments du bétail n'est pas encore totalement résolue.
Sur toutes ces questions, les débats et les échanges se poursuivent, démontrant qu'Internet peut être un moyen pertinent pour préfigurer une sorte de "forum citoyen" dans lequel les scientifiques peuvent mettre à la disposition de la société les connaissances acquises dans leurs laboratoires et percevoir immédiatement les questions que se posent leurs concitoyens à propos de leurs travaux de recherche.